合并慢性子宮內膜炎的反復著床失敗患者CD56+CD16+自然殺傷細胞水平的研究

黎 俏, 余建華, 薛永杰, 陳海霞, 賴放穎,全 燕, 何韶堅, 翁光明, 高天旸

(1. 南方醫科大學第二臨床醫學院, 廣東 廣州, 510515; 東莞康華醫院, 2. 生殖醫學科, 3. 血液中心實驗室,4. 病理科, 廣東 東莞, 523080; 5. 廣東省第二人民醫院 生殖醫學中心, 廣東 廣州, 510310)

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)周期中,胚胎著床率約30%[1]。反復著床失敗(RIF)的發生率可達5%～10%[2]。近年來關于慢性子宮內膜炎(CE)或免疫因素密切影響RIF預后的相關研究越來越多[3]。CD138檢測的CE患病率在RIF患者中為7.7%～44.0%[4]。CE持續炎癥將影響患者子宮內膜容受性,從而造成RIF、復發性流產(RM)等不良妊娠結局[5-6]。有研究[7]推測CE引起RIF的機制之一是病原微生物的入侵可能影響宮腔定植微生物,使子宮自然殺傷(uNK)細胞激活及T細胞亞群分化異常等,影響子宮的免疫環境,使子宮內膜容受性下降,導致胚胎植入失敗、胎盤形成不良。

人類子宮在生理狀態下含有大量的免疫細胞,特別是自然殺傷(NK)細胞[8]。uNK細胞與外周血自然殺傷(PbNK)細胞在活性、表型、功能和形態方面完全不同[9-10]。相較于PbNK細胞, uNK細胞是一種具有高度免疫調節性的NK細胞,可分泌細胞因子以促進血管新生和組織重構[11]。目前,大多數研究都采用CD56+CD16-uNK分型來鑒定uNK細胞,較少提及CD56+CD16+uNK細胞的功能。本研究分析了東莞康華醫院生殖中心RIF患者資料,探索RIF合并CE與uNK細胞的關系,評估合并CE的RIF患者外周血和子宮內膜的免疫狀態,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月—2023年2月就診于生殖醫學中心的年齡<40歲的82例患者為RIF組,均接受過IVF-ET移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上,但均未獲得臨床妊娠者[2]。另選擇同期在本中心行IVF-ET助孕的年齡<40歲的有IVF助孕妊娠活產史且擬再次助孕的82例患者為對照組。

納入標準: ① 年齡<40歲者; ② 因盆腔輸卵管因素行IVF助孕治療者; ③月經周期正常且規律者(26～31 d); ④ 夫妻雙方染色體正常者; ⑤ 生殖解剖結構正常者; ⑥ 內分泌正常者; ⑦ 無自身免疫性疾病者; ⑧ 無高凝血傾向者; ⑨ 無全身感染癥狀者; ⑩ 男方精液檢查正常者。

排除標準: ① 體質量指數(BMI)<18 kg/m2或>28 kg/m2者; ② 染色體異常者; ③ 生殖器官畸形者; ④ 輸卵管積液者,子宮內膜異位癥或腺肌癥者; ⑤ 內分泌指標異常者(合并糖尿病或高血壓或代謝性疾病); ⑥ 系統性紅斑狼瘡者(LA抗體陽性); ⑦ 自身抗體陽性者(抗核抗體、甲狀腺抗體、類風濕因子等); ⑧ 卵巢儲備功能減退者; ⑨ 子宮內膜不典型增生者; ⑩ 丈夫精液異常者。本研究開展前已獲得東莞康華醫院倫理委員會批準,所有患者均已告知實驗內容并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器: 貝克曼庫爾特Navios型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2.2 標本采集: 采用促黃體生成素(LH)測定試紙,于尿LH峰值出現后,在陰道B超監測排卵后第7～9天,采用子宮內膜取樣器吸取2份少量子宮內膜組織,一份采用流式細胞儀檢測子宮內膜CD56+CD16+uNK細胞水平; 另一份采用免疫組化方法檢測CD138。CD138陽性作為診斷CE的依據。

1.2.3 外周血: 所有受試者近3個月未服用任何甾體激素類藥物,于月經來潮第2～5天空腹采集肘部靜脈血液3～4 mL, 送檢驗科檢測促卵泡激素(FSH)、LH、雌二醇(E2)、孕酮(P)等水平; 超聲監測排卵后第7～9天的黃體中期,采用EDTA-K3采血管采集空腹肘靜脈血液3～4 mL, 并檢測PbNK細胞、血常規。

1.2.4 子宮內膜組織: 超聲監測排卵后第7～9天,采用一次性內膜取樣器取少量內膜,置于添加生理鹽水的無菌容器中保存。

1.2.5 流式細胞術檢測子宮內膜及外周血CD56+CD16+NK細胞表型的絕對計數方法: 采取流式細胞儀結合血細胞分析儀雙平臺絕對計數方法,首先通過流式細胞儀檢測熒光抗體標記呈陽性細胞百分比,然后利用血細胞分析儀獲得總細胞的絕對計數值,兩者乘積得到所檢測樣本中熒光標記呈陽性細胞的絕對計數值。

1.2.6 免疫組化結果的判定及CE的診斷: CD138在子宮內膜分泌期表達,主要表達于子宮內膜的腺上皮細胞、間質細胞和腔上皮細胞,呈深棕色染色,腺上皮細胞比間質細胞和腔上皮染色更強,見圖1。CE的診斷標準參考文獻[12]。免疫組化染色后CD138在漿細胞膜為強陽性,胞質為弱陽性。每高倍鏡視野下,子宮內膜間質中見到5個或以上典型的漿細胞,則診斷為CE; 見到5個以下典型的漿細胞,診斷為非CE。制片全過程均由有資質的技術員按照操作規范完成,病理診斷由具有獨立發放報告的診斷醫生共同完成閱片以及復核,每張片子均需要2位及以上病理科副主任醫師復核。

1.3 CE的治療及妊娠結局的追蹤

1.3.1 CE的治療及治療后復查: ① 對于確診的CE患者,全身性使用抗生素是目前公認的治療方法,口服抗生素為主要給藥方式。本研究CE陽性患者采用口服鹽酸多西環素片(100 mg, 2次/d, 用藥14 d)聯合甲硝唑片(400 mg, 2次/d, 用藥14 d)治療[13]。② 治療結束后下次月經周期黃體期時,采用子宮內膜取樣器吸取少量子宮腔內膜組織,采用免疫組化進行CE病理診斷。

1.3.2 CE患者的移植周期及內膜準備方法: CE患者完成1個療程抗炎治療且再次復查后,于月經第2～3天B超及性激素[LH、E2、P、人絨毛膜促性腺激素(HCG)]結果達基礎狀態后,采用激素替代治療(HRT)方案?？诜焖岽贫计?補佳樂, 1 mg/片, 拜耳醫藥制藥)12 d(4～6 mg/d)后,超聲監測內膜厚度和雌二醇、LH、P水平,若內膜≥8 mm時,給予黃體酮(黃體酮注射液, 20 mg/支,浙江仙琚制藥)60 mg/d肌內注射及地屈孕酮片(達芙通, 10 mg/片,荷蘭蘇威制藥)40 mg/d口服; 于黃體支持轉化內膜后行D3或D5胚胎移植,移植后繼續給予黃體支持: 黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾酮, 90 mg/支,默克雪諾蘭制藥)90 mg/d陰道給藥及地屈孕酮片(達芙通, 10 mg/片,荷蘭蘇威制藥)40 mg/d口服。

1.3.3 妊娠標準與觀察指標: 胚胎移植后10 d檢測血HCG水平,陽性者2周后超聲檢查見孕囊確診為臨床妊娠。觀察不同分組患者的臨床妊娠結局。臨床妊娠率=臨床妊娠周期/總移植周期×100%; 著床率=胚胎著床數/總移植胚胎數×100%; 早期流產率=孕12周內自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

A: 放大400倍表現; B: 放大200倍表現; C: 放大100倍表現。深棕色染色為陽性反應。圖1 顯微鏡下不同放大倍數免疫組化檢測CD138的表達與定位(SP法)

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。定量數據描述為均值±標準差, RIF組和對照組的參數數據分析采用t檢驗。RIF組合并CE、RIF組無合并CE、對照組合并CE、對照組無合并CE的黃體中期內CD56+CD16+uNK、CD56+CD16+PbNK細胞水平比例的分析采用卡方檢驗,組間CE治療后臨床妊娠率、早期流產率的分析采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。采用Pearson相關系數確定uNK與PbNK的相關程度,采用簡單線性回歸進行線性擬合。

2 結 果

2.1 RIF組與對照組的一般資料比較

2組年齡、不孕年限、基礎卵泡數、基礎性激素水平比較,差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 2組患者一般資料比較

2.2 2組NK細胞水平的比較

RIF組CD56+CD16+uNK細胞水平為(34.23±17.01)%, 低于對照組的(45.41±20.90)%, 差異有統計學意義(P<0.05); RIF組黃體中期外周血中CD56+CD16+PbNK細胞水平為(14.38±5.36)%, 與對照組的(13.58±4.34)%比較,差異無統計學意義(P>0.05); RIF組與對照組白細胞計數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。子宮內膜CD56+CD16+uNK細胞水平與外周血CD56+CD16+PbNK細胞水平無相關性(r=0.06), 見圖2。

表2 2組免疫細胞水平及外周血血常規指標比較

圖2 子宮內膜uNK細胞與外周血PbNK細胞水平的相關性分析(相關系數r=0.06)

2.3 2組合并CE時CD56+CD16+uNK細胞比較

RIF組合并CE與無合并CE、對照組合并CE與無合并CE的黃體中期內膜中CD56+CD16+uNK細胞、外周血中CD56+CD16+PbNK細胞水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 RIF組及對照組組內合并與無合并CE時免疫細胞水平比較

2.4 2組CE治療后妊娠結局比較

在RIF組合并CE、對照組合并CE患者中,治療后CE轉陰與CE仍為陽性者的年齡、移植日內膜厚度、平均移植胚胎數比較,差異無統計學意義(P>0.05); 在RIF組合并CE及對照組合并CE患者中,治療后CE轉陰者較CE仍為陽性者的臨床妊娠率、著床率均升高,早期流產率降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組CE治療后妊娠結局比較

3 討 論

胚胎因素、子宮因素、母體免疫異常等原因均可導致胚胎著床失敗。本研究結果顯示,伴有CE時, RIF組及對照組臨床妊娠率、著床率均下降,在經CE治療轉陰后,臨床妊娠率、著床率均顯著升高,早期流產率顯著降低(P<0.05)。CE持續炎癥的環境影響子宮內膜的容受性,相關機制可能與CE引起的內膜免疫異常、容受分子表達異常、蛻膜化異常和內膜蠕動異常等有關,也與CE患者存在病原菌感染或合并黏膜下肌瘤、息肉、子宮內膜異位癥等有關[14]。因此, CE對胚胎著床的影響極大, CE的確診和治療應作為反復著床失敗評估的重要因素。當RIF合并CE時,應合理治療CE,而不是單純采用免疫療法治療免疫細胞紊亂。

研究[15]表明uNK細胞數量在植入前和妊娠孕早期急劇上升,可達到蛻膜淋巴細胞的3/4,隨著滋養細胞侵入結束及胚胎逐步形成, uNK細胞慢慢發生凋亡,數目逐漸減少、消失。本研究結果發現, RIF組黃體中期CD56+CD16+uNK細胞水平顯著低于對照組,提示CD56+CD16+uNK細胞可能影響了RIF的過程。uNK細胞保護妊娠的機制可能是在胚胎植入后, uNK細胞通過表型轉變和受體及細胞因子譜的改變、增強對微生物感染的抵抗、子宮螺旋動脈的重構、加強免疫耐受等途徑來促進成功妊娠[16]。在種植窗時期, uNK和其他免疫細胞如樹突狀細胞、T-reg細胞、巨噬細胞等通過分泌正常妊娠需要的細胞因子和血管形成因子,控制螺旋動脈原位細胞的遷移,使滋養細胞向內膜適度遷移[17-18]。若滋養細胞侵襲不足,則發生免疫功能失衡,這種免疫失衡會導致外周和子宮蛻膜的慢性炎癥反應,進而導致妊娠丟失等相關病理狀況[19-20]。

本研究結果還顯示, RIF組與對照組黃體中期外周血中CD56+CD16+PbNK細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)。PbNK細胞是一種循環在外周血中的自然殺傷淋巴細胞,既往研究[21-22]多提示RIF患者PbNK細胞水平比正常生育史人群升高,其原因可能是血液檢測的PbNK結果受患者外周血狀態的變化影響[23], 從而產生偏倚。本研究檢測PbNK時同時檢測患者血常規狀態,發現RIF組與對照組血常規中白細胞計數、淋巴細胞百分比及中性粒細胞百分比均無顯著差異。此外,每個生殖機構對人體內正常的PbNK細胞水平并無統一標準,因此PbNK細胞正常范圍可能非常寬泛,在該范圍內對個人的妊娠狀態或許沒有明顯的影響[24]。

本研究發現,子宮內膜CD56+CD16+uNK細胞水平與外周血CD56+CD16+PbNK細胞水平無相關性(r=0.06), 提示uNK細胞和PbNK細胞具有不同的表型和功能特征。uNK在生殖過程中扮演有益角色,是實現胚胎植入、維持妊娠的基礎保障。母體淋巴細胞里的T細胞和大量獨特的uNK細胞可以識別子宮母胎界面的胎盤細胞,存在多種避免T細胞損傷胎兒的保護機制,從而猜測uNK細胞的激活可能是生理性的[25]。

局部內膜炎性細胞浸潤和炎癥介質滲出會改變子宮內膜微環境,影響子宮內膜容受性,不利于胚胎著床,最終可能導致RIF[26]。在RIF患者中,不同表型的uNK細胞計數水平也提示不同的致病機制,而這些改變是內源性免疫功能障礙所固有的,還是由外源性因素(如微生物群和病原體的改變)引起的,目前仍有待闡明。有研究[27]顯示在CE狀態下,子宮內膜分泌的細胞因子等表達異常,表現為促炎因子分泌增多,抗炎因子分泌降低,影響子宮內膜細胞的增殖與凋亡,導致母-胎界面的免疫平衡被打破,同時對胚胎產生細胞毒作用,影響胚胎植入過程。另有研究[28]分析其機制為CE可能通過雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的異常表達減弱子宮內膜基質細胞對孕激素的反應性,促進子宮內膜增殖潛能而抑制其分化潛能,影響蛻膜化的發生,對胚胎植入產生不利影響。研究發現,在RM患者中,與非CE組相比,CE對CD56+uNK細胞的比例無顯著影響[29]。本研究進一步分層分析發現,在RIF組、對照組中,合并CE者較無合并CE者的黃體中期內膜中CD56+CD16+uNK細胞、外周血中CD56+CD16+PbNK細胞水平均無顯著差異(P>0.05), 與前述報道相符合。黃體時期孕酮升高,該時期70%的子宮內膜是CD56+NK細胞,當黃體期即將結束時,孕酮水平下降,uNK細胞逐漸凋亡。因此,孕酮依賴的蛻膜細胞和uNK細胞的合作使基質向可接受植入的蛻膜基質轉化[30]。本研究所有受試者均于B超監測排卵后第7～9天的黃體中期取子宮內膜活檢標本,精確的同一時間段進行活檢可以減少結果中的誤差。

綜上所述, CD56+CD16+uNK細胞低表達可能導致母胎界面免疫紊亂,從而增加RIF發生的風險; 外周血CD56+CD16+PbNK細胞與子宮內膜CD56+CD16+uNK細胞無相關性; 抗生素治療CE能明顯改善RIF患者的妊娠結局, CE的確診和治療應作為RIF評估的重要因素。