實驗用物料濕熱滅菌實踐與改進建議

忻運 魏佳鳴

（上海市食品藥品包裝材料測試所 上海 201203）

高壓滅菌器是生物制藥行業的核心關鍵設備，適用于耐高溫、高壓、高濕的醫用器械或其他待滅菌品[1]。美國注射劑協會（Parenteral Drug Association，PDA）第48 號技術報告提示：GMP 要求的滅菌柜是一種濕熱滅菌柜，其建造應符合制藥行業衛生設計要求[2]。WHO對驗證的定義是：通過一系列活動產生文件證明某一程序（操作）能夠達到某個預期的目的[3]。

濕熱滅菌程序依賴于飽和蒸汽的直接接觸，此過程中蒸汽與液態水處于平衡狀態。濕熱滅菌過程中物理和微生物結果之間的一致性是滅菌驗證中最重要的部分[4]。按照賦予被滅菌品的殺滅效力衡量，應當從物理和生物兩方面來證明最低合格滅菌程序的合理性[5]。物理確認的目的是獲取物理數據并證明程序始終達到滅菌程序設計時確定的熱穿透要求。生物指示劑（biological indicator，BI）的目標是獲取所開發的滅菌程序實際達到了生物殺滅效力，BI 的選擇取決于滅菌方法和滅菌程序[6]。

本研究參考國內外濕熱滅菌指導原則，通過濕熱滅菌法嚴格實踐不同裝載程序和裝載模式下的滅菌工藝，嚴謹分析各項實驗數據結果，為實驗室濕熱滅菌提供一定的數據支撐。提出滅菌實驗人員應更多關注滅菌器冷點分析、最難裝載模式探討、D 值（decimal reduction time，是一個以分鐘計的時間單位，指某BI 或某菌群中90%的原有存活菌被殺滅所需的時間）與初始污染菌研究，為今后良好合規的濕熱滅菌器驗證作參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

HX-650-2D 型雙扉穿墻式滅菌器（德國Systec 公司）；TS Pro logger 型無線測溫儀；ETS-20 型溫度標準器；KB400 型培養箱（德國Binder 公司）；MIR-254 型培養箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 自含式壓力蒸汽滅菌生物指示劑

SA/6 型BI（批號SA-659，產品標稱存活孢子數2.5×106spores/unit，D 121 ℃值2.2 min、SASU/6 型BI（批號SASU-322，產品標稱存活孢子數2.3×106spores/unit，D 115 ℃值1.4 min），EZS/6 型BI（批號S-533，產品標稱存活孢子數1.7×106spores/unit，D 121 ℃值2 min）均購自美國Mesalabs 公司。

1.3 BD 測試包

CI-BDTLF 型Bowie-Dick（BD） 測 試 包（ 美 國Mesalabs 公司，批號BDT0321）。

1.4 方法

1.4.1 驗證計劃與裝載模式

本次濕熱滅菌驗證計劃的裝載類型分為固體裝載和液體裝載，滅菌驗證計劃見表1，裝載模式見表2。無線測溫探頭和BI 分布點見圖1，其中探頭之間間隔15 cm均勻分布在滅菌腔內，熱穿透時用滅菌膠帶將BI 與探頭固定，為確保驗證數據精確，配備14 個無線測溫探頭（2個備用）均經過前/后校準，目的是全面評估測溫以及賦予探頭新的偏差補償，各裝載模式見圖2[7-8]。

圖1 無線測溫探頭和BI分布點

圖2 物料裝載示意圖

表1 驗證計劃

表2 溫度、裝載方式及物料信息

1.4.2 滅菌程序

滅菌程序的選擇根據被滅菌品性質決定，具體可參考圖3 濕熱滅菌工藝決策樹[9-10]。本次固體待滅菌品和121 ℃液體待滅菌品參考采用“過度殺滅法”，115 ℃待滅菌品為不耐熱品參考采用“按產品特性設計法”——生物負載/生物指示劑法。針對飽和蒸汽滅菌程序中蒸汽質量的重要性需進行BD 測試以評估空氣去除和蒸汽 質量的有效性。

圖3 濕熱滅菌工藝決策樹

1.4.3 滅菌驗證可接受標準

利用無線測溫儀分析腔體內溫度數據以監測物理殺滅效果，經取樣培養，BI 呈陰性、陽性對照品呈陽性、陰性對照品呈陰性，表明微生物滅菌效果好。滅菌驗證可接受標準見表3。

表3 滅菌驗證可接受標準

2 結果

滅菌15 min 驗證后各項數據結果均符合“1.4.3 節表述的可接受標準”（表4）。

表4 滅菌驗證數據

各滅菌程序中典型的熱穿透溫度曲線圖譜以及BD測試通過的顯影圖和滅菌后BI 狀況分別見圖4、圖5 和圖6。

圖4 滅菌工藝溫度曲線圖

圖5 BD測試通過的顯影圖

圖6 滅菌后BI狀況

3 討論

3.1 D 值與初始污染菌研究

所有測試結果均符合滅菌驗證可接受標準。需要說明的是115 ℃液體滅菌程序的日常被滅菌品（RV 沙門菌增菌體液培養基）的滅菌溫度不可超過115 ℃[11]。在生物負載/生物指示劑法工藝中，BI 是通過生物學的方法來驗證滅菌效果，只要D 值足夠即使初始微生物數量低于106，使用BI 仍然可以驗證滅菌效果。D 值是評價滅菌生物指示劑產品質量的關鍵性技術參數，D 值越大，耐熱微生物殺滅速度越慢，該菌株的耐熱性越強[12]。對滅菌耐受性差的物品，其無菌保證應通過比較BI 與物品滅菌前微生物的污染水平（耐受性及微生物污染數量）及滅菌程序驗證所獲得的數據進行評估。建議今后115℃滅菌驗證重點關注耐受性差的物品初始污染菌監測以及D 值的研究，探索BI 的耐熱性與日常滅菌過程中出現的生物負荷耐熱性的不同，從而支持滅菌工藝的有效性，這也是新版藥典滅菌法以及國外各類指南中著重強調的。

3.2 冷點分析

通過分析9 次穿透數據以及無線測溫探頭分布位置可知，121 ℃固體程序冷點三次都分布在1#點位；115℃液體程序三次冷點分布在5#，8#，9#點位；121 ℃液體程序三次冷點分布在3#，6#，7#點位。進一步分析發現，121 ℃固體程序冷點固定，因為測溫探頭均放置在相對密閉的不銹鋼醫械器皿里面，所以這個區域是冷點區域。115 ℃液體程序冷點分布于8#點位區域周圍15 cm 左右，原因一是無線測溫探頭放置在大容量的灌封溶液里面，原因二是這個位置靠近排水口，所以這個區域是冷點區域。121 ℃液體程序冷點三次都比較分散，原因一是混合裝載模式空間有限且不均勻、原因二是溶液體積不均衡、原因三是待滅菌品在滅菌器網籃上的位置改變，上述原因都會影響改變冷點位置。

建議進行冷點研究以發現待滅菌品的最慢加熱位置。液體裝載冷點研究時可以通過將多個探頭放置于整個容器不同位置或水平面進行試驗來確定，所有試驗數據匯總確定冷點位置或區域。固體裝載冷點研究時，需要就待滅菌品的質量、空氣移除挑戰和冷凝積水的可能性進行評估。

3.3 最難裝載

雖然本次滅菌以滿載進行測試，但我們認為最難滅菌的裝載未必是最大裝載或最小裝載，建議專門進行滅菌器最難裝載模式驗證。可以運用主位點/主溶液方法來研究最難裝載模式，此方法可以最小化測試工作量。對于固體裝載，比如兩端開口的管子中間是最慢加熱位置，因為該位置的空氣最難排除、蒸汽也最難滲入。對于液體裝載主溶液就是指一個產品家族內所有溶液中賦予BI 最高D 值或抗性的溶液。熱穿透測試也可以使用替代溶液，但需要通過評估和比較整個產品的溶液黏度證明替代溶液黏度具有代表性。

綜上所述，高溫濕熱滅菌受到溫度、時間、物理殺滅力、生物殺滅力等多種因素影響。該實驗結果累計專業數據、積累寶貴經驗，可為濕熱滅菌器驗證提供了一定參考依據。