基于PINK1/Parkin通路研究天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠線粒體自噬的影響

雍蘇南，房赤，任衛瓊，劉林，蔣麗，喻珮，劉建和

湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

高血壓是我國患病人數最多的慢性非傳染性疾病之一，我國現有高血壓患者2.445億[1]，其常引起心、腦、腎等多器官功能破壞，是導致居民死亡的重要危險因素。血管內皮作為血管平滑肌和血液的重要機械屏障，可分泌多種血管收縮因子和舒張因子，以維持血管生理功能和正常血壓[2]。線粒體是保證內皮細胞正常功能最基本的細胞器之一，線粒體自噬失衡時，內皮細胞活性氧（ROS）產生增加，炎癥加重，導致內皮功能障礙，從而引發血管舒縮功能異常、血管重塑，導致血壓升高[3]。天麻芎苓止眩片為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，基于高血壓病“虛、瘀、風”病機，以平肝熄風、健脾逐瘀為治法創制，臨床使用多年，能明顯降低原發性高血壓肝火亢盛、痰熱內蘊證患者血壓，改善臨床癥狀，降低中醫證候積分[4]。動物實驗顯示，天麻芎苓止眩片可維持血管炎癥穩態，保護內皮功能[5]。基于此，本研究觀察天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠線粒體自噬的影響，進一步探討其治療高血壓病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性自發性高血壓大鼠30只，體質量210～235 g；SPF級雄性正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto）10只，體質量212～238 g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0011。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心標準動物房，使用許可證號SYXK（湘）2015-0003。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（ZYFY20200518-02）。

1.2 藥物及制備

天麻芎苓止眩片（天麻15 g，鉤藤15 g，川芎10 g，野菊花12 g，茯苓15 g，法半夏6 g，牡蠣6 g，地龍15 g，羅布麻18 g，酸棗仁9 g，香附10 g，丹參15 g，甘草6 g），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，批號20210812，0.46 g/片，用超純水配制成0.1 g/mL溶液。卡托普利片，中美上海施貴寶有限公司，批號20210823，12.5 mg/片，用超純水配制成0.76 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠ROS、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）ELISA試劑盒（武漢賽培，批號分別為SP13358、SP30131、SP13470、SP12914、SP12673），PTEN誘導假定激酶1（PINK1）、E3泛素連接酶（Parkin）、Beclin1一抗（美國Proteintech公司，貨號分別為23274-1-AP、14060-1-AP、11306-1-AP），GAPDH抗體（武漢貝茵萊，貨號PAB36269），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，貨號15596018），反轉錄試劑盒、RTqPCR mix（美國Promega公司，貨號分別為A3500、A6001）。

智能無創血壓計（北京軟隆科技有限公司，型號BP2010），全自動酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司，型號DNM-9602），生物組織石蠟包埋機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司，型號YB-8LF），透射電鏡（日立公司，型號HT7700），圖像采集系統（日本Olympus，型號BX50），電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6C），全自動化學發光分析儀（上海天能科技有限公司，型號Tanon-5200），定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號CFX Connect）。

1.4 分組及給藥

采用分層隨機法將30只自發性高血壓大鼠分為模型組、西藥組和中藥組，每組10只，將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常組。中藥組以1.0 g/kg灌胃天麻芎苓止眩片溶液，西藥組以7.6 mg/kg灌胃卡托普利溶液，正常組和模型組予蒸餾水灌胃，體積10 mL/kg，每日1次，連續6周。

1.5 指標檢測

1.5.1 收縮壓測量

分別于給藥前及給藥各周第7日9:00—11:00采用智能無創血壓計測量大鼠平靜狀態下尾動脈收縮壓，保證相同實驗條件，每只大鼠連續測量3次，取平均值。

1.5.2 血清氧化應激指標檢測

干預結束后24 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，開腹，取下腔靜脈血，3500 r/min離心15 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量。

1.5.3 胸主動脈形態觀察

取血后分離大鼠胸主動脈，置于10%福爾馬林溶液中固定，常規脫水，石蠟包埋，制成厚度5 μm切片，于45 ℃恒溫箱中烘干，脫蠟復水，經HE染色、透明、封片后，顯微鏡下觀察胸主動脈組織形態。

1.5.4 透射電鏡觀察

切取大鼠胸主動脈組織，置于2.5%戊二醛預固定，1%鋨酸后固定，丙酮、環氧樹脂脫水，聚合包埋箱聚合后，制成60 nm超薄切片，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛避光染色，透射電鏡觀察線粒體結構及自噬體數目。

1.5.5 免疫組化染色

石蠟切片70 ℃烤片2 h，經脫蠟、水洗后，高溫高壓法進行組織修復，3%過氧化氫溶液去除過氧化物酶，滴加PINK1、Parkin、Beclin1一抗（均為1∶100），4 ℃孵育24 h，PBS洗滌后，滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色5 min，蘇木素復染，脫水、透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達，Adobe Photoshop圖像分析軟件計算陽性表達的積分光密度（IOD）。

1.5.6 Western blot檢測

胸主動脈組織加入RIPA裂解液提取總蛋白，4 ℃、12000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，凝膠電泳后，200 mA轉膜（PVDF膜）1 h，使用5%脫脂牛奶（0.5%TBST配制）封閉1 h，加入PINK1、Parkin、Beclin1一抗（均為1∶1000）、GAPDH一抗（1∶5000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3000），室溫孵育30 min，洗膜，ECL顯影，以GAPDH為內參，AlphaEase FC軟件分析目的蛋白相對灰度值。

1.5.7 RT-qPCR檢測

胸主動脈組織加入Trizol試劑，4 ℃勻漿20 s，加入氯仿200 μL，搖勻，室溫靜置2 min，4 ℃、12000 ×g離心10 min，取上清液，加入等體積異丙醇，靜置、離心后，加入75%乙醇1 mL漂洗沉淀，離心2次，加入DNase/RNase-Free Water 40 μL溶解RNA，按試劑盒說明書反轉錄成cDNA。PCR條件：95 ℃、3 min，95 ℃、3 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統計學方法

采用SPSS24.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較服從正態分布且方差齊用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布或方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠收縮壓的影響

與同一時點正常組比較，模型組大鼠收縮壓顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與同一時點模型組比較，西藥組給藥第1周收縮壓開始下降，中藥組給藥第3周收縮壓開始下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），且中藥組收縮壓高于西藥組（P＜0.05），給藥第5、6周，中藥組與西藥組收縮壓差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時點收縮壓比較（±s，mm Hg）

表2 各組大鼠不同時點收縮壓比較（±s，mm Hg）

注：1 mm Hg=0.133 kPa；與同一時點正常組比較，*P＜0.05；與同一時點模型組比較，#P＜0.05；與同一時點西藥組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組西藥組中藥組給藥第6周117.39±10.21206.19±15.25*131.84±14.08#134.58± 8.53#只數1010 1010給藥前118.11± 8.03185.77±27.45*176.38±11.87179.70±12.20給藥第1周118.39±12.26189.82±18.33*160.55±10.81#177.98± 9.58▲給藥第2周115.52± 6.43183.00±16.30*145.20± 8.72#172.92± 9.50▲給藥第3周120.19±11.24187.82±20.42*140.13± 9.31#162.46±17.82#▲給藥第4周117.80± 5.45195.03±24.76*136.66± 8.92#150.52±10.85#▲給藥第5周114.49± 4.83200.25±28.49*135.62±14.30#138.55±13.33#

2.2 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠血清氧化應激指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ROS、MDA含量顯著升高，CAT、SOD、GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組大鼠血清ROS、MDA含量顯著降低，CAT、SOD、GSH含量顯著升高（P＜0.05）；中藥組與西藥組CAT、SOD、GSH差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05

GSH/（nmol/L）131± 6.2176.71±10.37*103.49±11.32#116.86± 7.65#▲組別正常組模型組西藥組中藥組只數1010 1010 ROS/（U/mL）39.47±15.6574.67±10.29*53.53±11.93#50.64±13.54#MDA/（nmol/mL）3.92±0.429.82±0.31*6.37±0.49#6.76±0.51#CAT/（U/mL）12.35±0.576.21±0.36*9.12±0.43#8.87±0.53#▲SOD/（U/mg）142.65±8.6586.27±7.41*126.46±8.32#116.45±9.79#▲

2.3 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈組織形態的影響

正常組胸主動脈組織血管平滑肌細胞排列規則，內膜較完整，管壁未見增厚；與正常組比較，模型組胸主動脈組織平滑肌細胞增生肥大、排列欠規則，內膜粗糙、缺損，管壁增厚；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織平滑肌細胞增生減少、排列較規則，管壁厚度接近正常。見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈組織形態（HE染色， ×400）

2.4 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈內皮細胞線粒體結構及自噬體數目的影響

正常組胸主動脈內皮細胞線粒體結構較完整，線粒體嵴明顯，無空泡；模型組胸主動脈內皮細胞線粒體明顯腫脹，內部嵴結構破壞或消失，可見大量包裹自噬溶酶體的自噬泡及少量自噬體；與模型組比較，西藥組胸主動脈內皮細胞可見少量正常線粒體，自噬泡減少，中藥組胸主動脈內皮細胞線粒體損傷明顯改善，可見少量包裹自噬溶酶體的自噬泡。見圖2。

2.5 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈組織PTEN誘導假定激酶1、E3泛素連接酶、Beclin1蛋白表達的影響

免疫組化染色顯示，正常組胸主動脈組織未見明顯棕黃色染色；與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1陽性表達（免疫組化染色，×400）

表4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達比較（±s，IOD）

表4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達比較（±s，IOD）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別正常組模型組西藥組中藥組Beclin128.81± 3.65126.19±26.72*78.54± 7.63#92.56±15.39#只數1010 1010 PINK1204.36± 25.63601.86±108.54*346.59± 53.19#317.18± 41.11#Parkin 73.37± 16.88528.01±119.21*129.10± 41.64#119.87± 19.21#

Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

表5 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

Beclin11.01±0.104.01±0.15*2.03±0.13#2.86±0.10#組別正常組模型組西藥組中藥組只數1010 1010 PINK11.03±0.083.54±0.72*2.42±0.52#2.18±0.41#Parkin 0.96±0.064.16±0.69*2.76±0.53#2.13±0.46#

2.6 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈組織PTEN誘導假定激酶1、E3泛素連接酶、Beclin1 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達比較（±s）

表6 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

Beclin11.17±0.092.19±0.64*1.71±0.32#1.35±0.09#組別正常組模型組西藥組中藥組只數1010 1010 PINK11.02±0.256.40±1.08*2.71±0.94#2.22±0.41#Parkin 1.00±0.107.42±1.08*2.26±0.42#1.96±0.38#

3 討論

根據臨床癥狀，高血壓病屬中醫學“眩暈”“頭痛”等范疇。臨床研究發現，“虛、瘀、風”的病機狀態貫穿高血壓病始終[6-7]，天麻芎苓止眩片對高血壓病有多成分、多靶點、多途徑的干預效果[4-5]。方中天麻味甘、性平，歸肝經，可熄風止痙、平抑肝陽、祛風通絡；鉤藤、川芎清熱熄風、活血行氣；茯苓、法半夏、野菊花健脾化痰、平肝清熱；地龍、香附、丹參疏肝理氣、祛瘀通絡；牡蠣、羅布麻、酸棗仁滋陰潛陽、養肝清熱；甘草調和諸藥。諸藥相伍，在平肝熄風同時健運脾氣、清熱化痰、祛瘀通絡。前期研究表明，天麻芎苓止眩片可降低血清白細胞介素（IL）-1、IL-10含量，降低胸主動脈組織Atg8、LC3表達，調節基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶抑制因子2表達，從而恢復自噬穩態、減輕內皮損傷、逆轉血管重塑、降低血壓[5，8-9]。本研究觀察到，模型組大鼠胸主動脈內皮細胞線粒體結構破壞，出現大量自噬泡和自噬體，血清ROS、MDA含量升高，CAT、SOD、GSH含量降低，說明高血壓狀態下線粒體自噬明顯。天麻芎苓止眩片干預后，模型大鼠血壓顯著降低，血清ROS、MDA含量降低，CAT、SOD、GSH含量升高，胸主動脈內皮細胞線粒體損傷明顯改善，自噬泡和自噬體數目減少，表明天麻芎苓止眩片可減輕氧化應激，調節線粒體過度自噬，保護內皮功能。

內皮損傷是高血壓病內皮細胞被激活的典型特征[10]，包括血管通透性增加、氧化應激水平升高、不同內皮來源信使的釋放失衡，以及血栓前和促炎表型等，而內皮細胞線粒體自噬失衡是內皮損傷的關鍵機制之一[11-12]。PINK1/Parkin通路是研究線粒體自噬相關疾病的經典通路[13-14]。生理狀態下，磷酸酶與張力蛋白同源物將PINK1誘導進入線粒體后降解。在健康線粒體中，由于轉錄后調節和蛋白水解的快速降解，PINK1維持在低水平。在受損線粒體中，線粒體膜去極化后損傷部分被暴露出來，PINK1在去極化的膜表面大量聚集并募集Parkin，PINK1在Ser65位點對Parkin進行磷酸化，活化的Parkin促使線粒體表面蛋白泛素化，持續聚集p62，最后經p62-LC3進入自噬-溶酶體系統降解[15]。Beclin1是哺乳動物主要的自噬調節基因，在自噬初始階段，其通過與PI3KC3結合參與自噬體形成，從而起到關鍵作用[16]。線粒體過度自噬時，小鼠血管內皮功能受損，導致主動脈收縮功能下降，Beclin1表達也明顯上升[17]。本研究發現，模型組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表達顯著升高，經天麻芎苓止眩片干預后，模型大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表達顯著降低，表明其可能通過調控PINK1/Parkin通路調節線粒體過度自噬，減輕氧化應激損傷。

綜上，天麻芎苓止眩片可能通過調節PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬逆轉血管內皮氧化應激損傷，維持血管內皮功能穩態，從而發揮降壓作用。