基于PI3K-Akt信號通路的清帶湯對大腸癌細胞增殖的影響

陳彥華，陳佳旻 ，劉蕾 王連潔 吳范晨 馮媛媛 周利紅

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203；2.上海中醫藥大學中西醫結合研究院，上海 201203；3.上海浦南醫院，上海 200125

大腸癌又名結直腸癌，是臨床最常見的消化系統惡性腫瘤，發病率和病死率均呈逐年上升趨勢。根據全球癌癥統計報告2020年最新統計數據顯示，2020年全球大腸癌病例新增193萬（10.0%），占第3位，死亡病例94萬（9.4%），占第2位[1]。2020年，中國大腸癌病例新增56萬（12.3%），占第2位，死亡病例29萬（9.7%），占第5位[2]。早期大腸癌治療以手術切除為主，中晚期輔以放療、化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療方案。中藥以其低毒性、多靶點、多部位及綜合性的特點在臨床廣泛應用，挖掘有效治療大腸癌的中藥復方具有重要的臨床意義。

清帶湯出自《醫學衷中參西錄》，由山藥、茜草、海螵蛸、龍骨和牡蠣組成，具有固元化滯、活血散瘀之功。課題組臨床實踐中常用該方加減治療大腸癌術后放療、化療患者，能減輕患者放化療不良反應、提高生活質量。本研究觀察清帶湯對人大腸癌細胞（HCT116、LoVo、HT29）及荷瘤裸鼠的抑制作用，采用網絡藥理學和分子對接技術分析清帶湯治療大腸癌的分子機制，并通過Western blot和qPCR實驗進行驗證，為該方治療大腸癌的臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人大腸癌HCT116、LoVo、HT29細胞，購于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號分別為CL-0096、CL-0144、CL-0118，于上海中醫藥大學附屬曙光醫院腫瘤研究室保存。正常人腸上皮NCM460細胞，上海中醫藥大學附屬龍華醫院脾胃病研究所徐漢辰教授課題組惠贈。

1.2 動物

SPF級BALB/c雄性裸鼠10只，4周齡，體質量16～18 g，購于上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可證號SCXK（滬）2017-0012。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，自由攝食飲水。適應性飼養1周后進行實驗。動物飼養及實驗操作符合相關管理要求并通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（PZSHUTCM220711016）。

1.3 藥物

清帶湯由山藥30 g、茜草9 g、海螵蛸12 g、龍骨18 g、牡蠣18 g組成，飲片購于上海康橋中藥飲片有限公司，批號分別為220211、220222、220317、220310、220218，上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房提供。稱取各中藥飲片，常規水煎并濃縮，得到濃縮液（相當于原藥材1.16 g/mL）用于動物實驗，4 ℃冷藏備用。稱取各中藥飲片，放入2000 mL圓底燒瓶，加入600 mL蒸餾水，室溫浸泡1 h后煎煮，煎煮至液體剩余200 mL，過濾，4 ℃靜置，待溫度降至室溫，加入無水乙醇1000 mL，4 ℃靜置48 h，過濾，取濾液，減壓濃縮至無醇味[3]，凍干機真空干燥，即得凍干粉，置于-80 ℃冰箱保存，用于細胞實驗。凍干粉得率為0.115 g凍干粉/1 g原藥材。

1.4 試劑與儀器

CCK-8試劑盒（日本東仁化學研究所，批號SB793），RPMI-1640培養基（中科邁晨科技有限公司，貨號CM10040），DMEM培養基（中科邁晨科技有限公司，貨號CM10013），F-12K培養基（上海源培生物科技股份有限公司，貨號L450KJ），胎牛血清（美國Gibco公司，貨號2324371），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術研究所，貨號C0201），β-actin單克隆抗體（美國CST公司，貨號3700S），mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）單克隆抗體（美國CST公司，貨號分別為2983T、2971S、4691S、13038T、4060T），HRP標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術研究所，貨號A0208），HRP標記山羊抗鼠IgG（上海碧云天生物技術研究所，貨號A0216），ECL化學發光超敏顯色試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，貨號36208ES60）。

240i恒溫CO2細胞培養箱（美國Thermo公司），SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司），SVE-6A1型超凈工作臺（新加坡ESCO公司），5804R臺式高速離心機（德國Eppendorf公司），680酶標儀（美國Bio-Rad公司），1658004蛋白轉印系統（美國Bio-Rad公司），4600SF化學發光圖像分析系統（上海天能科技）。

2 實驗方法

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數生長期人大腸癌HCT116、LoVo、HT29細胞及人正常腸上皮NCM460細胞，常規消化后，分別以5000、8000、5000、6000個/孔接于96孔板，待細胞貼壁后，分別加入各細胞系對應的培養基（RPMI-1640、F-12K、DMEM、RPMI-1640培養基）配制的清帶湯凍干粉溶液（10、20、40、80、160 μg/mL），對照組加入相應培養基常規培養，每組5個復孔，另設空白孔只加培養基，不接種細胞，置于培養箱中培養48 h。細胞用PBS清洗2次，加入90 μL培養基和10 μL CCK-8試劑，置入培養箱孵育1～2 h，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（OD值），計算細胞存活率。存活率（%）=（給藥組OD值-空白孔OD值）÷（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。

2.2 裸鼠皮下移植瘤模型建立、給藥及取材

無菌條件下取10只裸鼠，于單側腋窩皮下注射1×107/mL HCT116細胞懸液0.1 mL，待注射部位皮下出現2～3 mm硬質腫物時，將裸鼠隨機分為對照組和清帶湯組，每組5只。清帶湯組予清帶湯濃縮液11.6 g/kg（相當于臨床等效劑量）灌胃，對照組予等體積飲用水灌胃，連續21 d。每3日測量瘤體最長直徑（A）和最短直徑（B），計算瘤體積（A×B2÷2），繪制腫瘤相對生長曲線。末次給藥24 h后異氟烷麻醉，心臟取血處死，剝離瘤體并稱重。

2.3 網絡藥理學分析

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、HERB（http://herb.ac.cn/）數據庫結合中國知網（https://cnki.net/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索，獲取清帶湯組成藥物有效成分。以口服生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為條件篩選有效成分，將文獻記載有良好藥理作用但不符合上述條件的成分也補充作為有效成分。通過TCMSP、HERB、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）數據庫及PubMed獲得清帶湯有效成分的潛在靶點。利用GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）數據庫收集大腸癌相關靶點蛋白，采用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲取清帶湯有效成分治療大腸癌的潛在靶點。在STRING11.5（https://string-db.org/）數據庫選擇多種蛋白質（Multiple Proteins），物種（Organism）選擇智人（Homo sapiens），置信度設為中等置信度（medium confidence=0.9），輸入清帶湯治療大腸癌潛在靶點信息，獲得蛋白相互作用（PPI）關系，將結果數據導入Cytoscape3.9.1軟件構建清帶湯治療大腸癌潛在靶點PPI網絡。采用基于R語言的clusterProfiler包對清帶湯治療大腸癌潛在靶點進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，篩選條件為pvalue＜0.05和qvalue＜0.05。利用SwissADME（http://www.swissadme.ch/index.php）對核心有效成分的ADME參數、藥代動力學特性、藥物性質進行描述或預測。

2.4 分子對接

將篩選出的核心有效成分與對應靶蛋白進行分子對接，預測其結合模式和親合力，輔助判斷清帶湯對大腸癌的調控機制。首先在TCMSP和PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲取核心有效成分的2D結構，再通過Chem3D軟件轉化為3D結構。采用RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載核心靶點的蛋白結構，應用PyMOL軟件對受體進行除水及小分子配體等操作，再應用AutoDock Vina進行分子對接，得到對接最低結合能。

2.5 細胞實驗驗證

取對數生長期HCT116和LoVo細胞，常規消化后，分別以5×105、1×106個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，清帶湯組分別加入相應培養基配制的半抑制濃度（IC50）清帶湯凍干粉溶液[4]，對照組加入對應培養基常規培養，每組3個復孔，置于培養箱培養48 h。

2.5.1 qPCR檢測

收集細胞，采用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度，使用RNA反轉錄試劑，按照說明書步驟將總RNA反轉錄為cDNA。配制PCR體系進行擴增，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由通用生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.5.2 Western blot檢測

培養結束后，PBS清洗細胞，每孔滴加蛋白裂解液60 μL（RIPA裂解液∶PMSF∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶2∶2），冰上裂解30 min，4 ℃、12000 r/min離心20 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，加入5×loading buffer，沸水浴10 min，使用PAGE凝膠快速制備試劑盒制膠（7.5%），上樣，電泳，將蛋白電轉至PVDF膜，用5%BSA室溫封閉2 h。PBST洗膜3次，每次10 min，加入β-actin、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR一抗（均為1∶1000），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯影。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 動物實驗驗證

將2組裸鼠腫瘤組織研磨后，分別提取RNA，采用qPCR檢測相關基因表達。

3 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料以±sx表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 清帶湯對大腸癌細胞增殖的影響

20～160 μg/mL清帶湯處理HCT116、LoVo、HT29細胞48 h后，均能顯著抑制細胞增殖，降低其存活率（P＜0.05，P＜0.01），HCT116、LoVo細胞IC50分別為40、60 μg/mL。而10～160 μg/mL清帶湯處理正常人腸上皮NCM460細胞48 h后對細胞增殖無明顯影響（P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度清帶湯對大腸癌細胞及正常人腸上皮細胞存活率比較（±sx，n=5）

4.2 清帶湯對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

造模后第8日開始記錄腫瘤體積，實驗過程中對照組瘤體生長速度高于清帶湯組，給藥21 d后清帶湯組腫瘤體積和質量均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組裸鼠腫瘤體積和質量比較（±sx，n=5）

4.3 網絡藥理學分析結果

4.3.1 清帶湯有效成分篩選

通過TCMSP數據庫檢索并根據OB＞30%、DL＞0.18篩選，得到清帶湯中茜草和山藥有效成分35個，未被TCMSP收錄的3味中藥（海螵蛸、龍骨、牡蠣）通過HERB數據庫和文獻檢索，獲得海螵蛸有效成分6個、龍骨有效成分5個、牡蠣有效成分7個。刪除重復數據后，獲得清帶湯有效成分共52個。

4.3.2 藥物-疾病共同靶點

通過TCMSP、HERB、SwissTargetPrediction、STITCH數據庫及PubMed檢索獲取清帶湯有效成分作用靶點，去除重復靶點后，得到作用靶點340個。通過GeneCards和OMIM數據庫檢索得到大腸癌相關靶點1561個。對清帶湯作用靶點和大腸癌相關靶點取交集，得到清帶湯治療大腸癌潛在靶點141個。

4.3.3 蛋白相互作用網絡構建

通過STRING11.5對清帶湯治療大腸癌潛在靶點進行分析，利用Cytoscape3.9.1軟件構建PPI網絡（見圖3），該網絡包含140個靶點、561條邊，靶點代表蛋白，邊代表蛋白與蛋白的相互作用關系，連線越多表示關聯度越大，靶點蛋白平均節點度為8.01。

圖3 清帶湯治療大腸癌潛在靶點PPI網絡

4.3.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

對清帶湯治療大腸癌的141個潛在靶點進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析。GO功能注釋顯示，生物過程主要富集在miRNA的轉錄調控、細胞對生長因子刺激的反應、酶聯受體蛋白信號通路、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路、細胞對TGF-β刺激的反應及TGF-β信號通路等；細胞組分主要富集在轉錄調控/抑制復合體、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節因子復合物、細胞膜的維持等；分子功能主要富集在蛋白的磷酸化結合、核心啟動子序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合等。見圖4。KEGG通路富集分析主要涉及PI3K-Akt信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等（見圖5）。排除非特異性通路及與大腸癌關聯較小的通路后，發現其與PI3K-Akt信號通路密切相關。

圖4 清帶湯治療大腸癌潛在靶點GO功能富集分析

圖5 清帶湯治療大腸癌潛在靶點KEGG通路富集分析

4.3.5 PI3K-Akt信號通路關鍵靶點篩選及清帶湯核心有效成分篩選

通過R語言clusterProfiler包對清帶湯治療大腸癌的有效成分及靶點進行篩選與分析，以pvalue＜0.05為篩選條件，發現清帶湯中共有16個有效成分及其對應的20個靶點參與PI3K-Akt信號通路抑制大腸癌細胞增殖過程（見圖6）。根據上述20個靶點進行篩選，挑選出PI3K-Akt信號通路核心靶點PIK3CG、AKT1、MTOR，并找出其對應的核心有效成分10個，見表2。

4.3.6 分子對接

選擇核心靶點PIK3CG、AKT1、MTOR及清帶湯核心有效成分，通過AutoDock Vina進行分子對接結合能力分析，AutoDock結合能＜-5.0 kcal/mol表明具有良好結合能力[5]。結果顯示，各有效成分與對應靶點有良好的結合能力。見表3。

表3 清帶湯核心有效成分與PI3K-Akt信號通路關鍵靶點分子對接結果（kcal/mol）

4.4 清帶湯對HCT116和LoVo細胞PI3K-Akt信號通路相關蛋白和基因表達的影響

Western blot結果顯示，清帶湯組HCT116和LoVo細胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖7、表4。qPCR結果顯示，清帶湯組HCT116和LoVo細胞PI3K-Akt信號通路下游基因CDK2、BCL-2和MCL-1表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

圖7 各組細胞PI3K-Akt信號通路相關蛋白免疫印跡

圖8 各組細胞PI3K-Akt信號通路相關基因表達比較（±sx，n=6）

表4 各組細胞PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達比較（±sx）

表4 各組細胞PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達比較（±sx）

注：與相應細胞對照組比較，*P＜0.05

細胞HCT116 LoVo p-mTOR 0.69±0.060.46±0.02*0.60±0.100.37±0.09*組別對照組清帶湯組對照組清帶湯組n3333 AKT 0.54±0.160.52±0.160.50±0.080.50±0.04 p-AKT 0.71±0.100.43±0.03*0.66±0.140.37±0.15*mTOR 0.74±0.100.68±0.150.69±0.070.79±0.23

4.5 清帶湯對裸鼠腫瘤組織PI3K-Akt信號通路相關基因表達的影響

qPCR結果顯示，清帶湯組裸鼠腫瘤組織PI3K-Akt信號通路下游基因CDK2、BCL-2和MCL-1表達均顯著降低（P＜0.01），見圖9。

圖9 各組裸鼠腫瘤組織PI3K-Akt信號通路相關基因表達比較（±sx，n=6）

5 討論

大腸癌可歸屬中醫學“積聚”“腸風”“臟毒”等范疇，其病機總屬本虛標實，常見為正氣虧虛、癌瘀內阻[6]。吳行等[7]通過數據挖掘發現，“虛滯”在大腸癌發展中有重要地位，故治療需在扶正固本基礎上配合消瘀化滯、軟堅散結之法。司富春等[8]對近30年中藥治療大腸癌用藥規律進行分析也發現，補虛藥和祛瘀藥占較高比例。

根據大腸癌正氣虧虛、癌瘀內阻的病機，清帶湯以山藥固元氣，茜草、海螵蛸化滯祛瘀，龍骨祛痰化濁，牡蠣軟堅散結[9]。張錫純提出“大腸病則流白痢，子宮病則流白帶，其理相同”的觀點，為清帶湯用于大腸癌的治療提供理論基礎。同時，張錫純“嘗考神農本經，龍骨善開癥瘕，牡蠣善消……兼具開通之力也……烏魚骨即海螵蛸，茹蘆即茜草，是二藥為開通之品。”全方共奏扶正固本、消瘀化滯、軟堅散結之功。

本研究通過CCK-8實驗發現，清帶湯對體外培養的人大腸癌HCT116、LoVo、HT29細胞增殖具有明顯抑制作用，而對人腸上皮NCM460細胞增殖無明顯影響。為進一步明確清帶湯在體內的抑瘤作用，通過荷瘤裸鼠模型發現，清帶湯能明顯抑制裸鼠移植瘤生長。由此可見，清帶湯在治療大腸癌方面有良好的應用前景。

通過網絡藥理學對清帶湯治療大腸癌的潛在靶點進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析，排除非特異性通路及與大腸癌關聯較小的通路后，發現其與PI3K-Akt通路密切相關，并發現核心靶點PIK3CG、AKT1、MTOR，基于核心靶點篩選出核心有效成分alizarin、mollugin、chitosan、diosgenin和(-)-taxifolin等。對核心靶點與有效成分進行分子對接結合能力分析，配體與受體蛋白間的結合受范德華力、靜電相互作用及氫鍵等影響，通常AutoDock結合能越低說明結合能力越強。結果顯示，各有效成分與核心靶點具有較高親和力，推測清帶湯可能通過調控PI3K-Akt信號通路抑制大腸癌。

研究表明，PI3K-Akt信號通路能調節大腸癌細胞增殖[10-12]，是包括大腸癌在內的多種癌癥常見的調控通路之一[13-15]。PI3K是一種細胞內脂質激酶，PI3K信號通路的激活可以由癌基因PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG等誘發，也可以由受體酪氨酸激酶和活化的Ras等激活[16]，PI3K將磷脂酰肌醇4,5二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（PIP3），隨后PIP3在細胞膜上積累導致AKT募集[17]，AKT可以磷酸化和抑制凋亡及細胞周期阻滯蛋白[18]，并激活mTOR[19]。PI3K突變常見于轉移性或晚期癌癥，表明其可能有助于癌細胞的進化和遠處擴散[20]。PIK3CA的突變基因被描述為腺瘤-癌序列中的晚期事件[21]。AKT是PI3K信號傳導的關鍵下游靶點，在大腸癌發生發展的各個環節都起著重要作用，包括增殖、侵襲、轉移和預后[22]。正常結腸黏膜和增生性息肉AKT表達較低，而結直腸腺瘤和腫瘤中可高表達AKT[23]。本研究通過Western blot和qPCR檢測清帶湯對大腸癌細胞PI3K-Akt信號通路相關蛋白和基因表達的影響以驗證網絡藥理學預測結果。結果顯示，清帶湯組大腸癌細胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達較對照組下調；體內外實驗中，清帶湯組PI3K-Akt信號通路重要下游基因CDK2、BCL-2和MCL-1表達較對照組均顯著下降。綜合以上檢測結果，推測清帶湯可能通過調控PI3K-Akt信號通路抑制大腸癌細胞增殖。

綜上所述，清帶湯在體內外均能抑制大腸癌細胞增殖，同時具有一定的安全性。結合網絡藥理學和分子對接技術及實驗驗證，表明清帶湯抑制癌細胞增殖與調控PI3K-Akt信號通路有關。現有研究結果既能體現中醫學“異病同治”的辨證思維，又能體現中醫藥抗腫瘤減毒增效的治療特色，同時為后期系統、深入闡明藥物作用機制提供參考，豐富傳統復方治療大腸癌的思路與方法，擴大復方的適應證范圍。對于清帶湯中有效成分的挖掘尚需進一步深入。