隔藥餅灸對免疫抑制兔調節性B細胞介導的TIGIT/CD155和JAK2/STAT3信號通路的影響

毛凱榮 ，熊羅節 ，田岳鳳 ，徐小珊 ，翟春濤 ，李瑋

1.廣州中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518034； 2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.山西中醫藥大學，山西 晉中 030619

機體免疫系統能夠通過識別“自己”與“非己”，從而祛除對人體產生危害的抗原，并對人體自身產生的不利于發揮正常生理功能的細胞或損傷進行清除或修復。“正氣存內，邪不可干”（《素問·刺法論篇》），正氣的作用就是抵御病邪。“陰陽俱虛，火自當之”（《靈樞·官能》），艾灸有補虛培元作用，能治療由于正氣虛而引起的慢性病癥。現代研究從不同角度證實艾灸與免疫有密切關系[1-2]。

課題組前期研究表明，隔藥餅灸能通過調控免疫細胞和相關分子，一定程度上改善和恢復免疫抑制狀態的機體免疫功能[3]。在此基礎上，本研究從隔藥餅灸通過調節性B細胞（Breg）介導的TIGIT/CD155和JAK2/STAT3信號通路出發，探究其影響免疫功能的機制及不同指標間的相關性。

1 材料與方法

1.1 動物

普通級日本大耳白兔32只，雌雄各半，體質量（2.3±0.3）kg，北京西山昌揚養殖中心提供，動物許可證號SCXK（京）2016-0007。飼養于溫度20～24 ℃、相對濕度40%～60%環境。本實驗嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導意見》相關規定，并通過山西中醫藥大學動物倫理委員會批準（2016DW019）。

1.2 藥物及制備

熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮，由山西中醫藥大學附屬醫院中藥房提供。艾絨購于北京同仁堂中藥飲片有限責任公司，批號1808026。用模具將艾絨制成半徑0.3 cm、高0.5 cm、質量為（0.3±0.03）g圓錐形艾炷。用卷煙器將質量為（1.5±0.25）g的艾絨制成艾條。

將熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8∶4∶4∶3∶3∶3比例混合后過120目篩磨成粉，將藥粉、賦形劑（小麥粉）和水按1∶1∶1.2比例混合均勻，使用模具制成半徑0.4 cm、高0.4 cm、質量為（0.9±0.05）g藥餅。

1.3 主要試劑與儀器

環磷酰胺（批號22011925），江蘇盛迪醫藥有限公司；白細胞介素（IL）-10、CD155、TIGIT ELISA試劑盒（批號均為20210703A），上海酶聯生物科技有限公司；JAK2抗體（批號FL-6001）、STAT3抗體（批號714094），北京博奧森生物技術有限公司；TIGIT抗體（批號PAB180017），艾博抗（上海）貿易有限公司；增強型RIPA裂解液（批號AR0102），武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號AR0146），武漢博士德生物工程有限公司；75%醫用乙醇（批號20191002），山東安捷高科消毒科技有限公司。

電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYCZ-24DN），電轉儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYCZ-40B），酶標儀（蘭雷勃集團，型號MK3），水浴鍋（德國徠卡，型號HI1210），成像系統（上海天能科技有限公司，型號Tanon-5200），正置顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號CX41），石蠟切片機（湖北徠克醫療儀器有限公司，型號SQ2125），數碼相機（日本尼康，型號D510）。

1.4 分組及造模

動物按體質量采用隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、艾條灸組和隔藥餅灸組，每組8只。適應性喂養1周后開始造模，將環磷酰胺用生理鹽水配制成濃度為20 mg/mL溶液，模型組、艾條灸組和隔藥餅灸組按60 mg/kg腹腔注射，連續7 d[4]，空白組每日腹腔注射等體積生理鹽水。以進食量減少、毛色光澤度降低、掉毛量增加和精神狀態萎靡為造模成功標準。

1.5 干預

參照《實驗針灸學》[5]動物腧穴定位法及擬人比照法，選取“神闕”“關元”“足三里”“脾俞”“腎俞”。艾條灸組先將兔俯臥位固定于兔臺，使用艾灸架將自制艾條置于雙側“脾俞”“腎俞”“足三里”上3 cm處，用線香點燃，待俯臥位施灸結束后，再以仰臥位固定兔，同法于“神闕”“關元”施灸，每穴每次灸1壯，隔日灸，共10次。隔藥餅灸組先將兔俯臥位固定于兔臺，將制備的藥餅放于雙側“脾俞”“腎俞”“足三里”，上置艾炷，用線香點燃艾炷施灸，待俯臥位施灸結束后，再以仰臥位固定兔，同法于“神闕”“關元”施灸，每穴每次灸5壯，隔日灸，共10次。空白組和模型組只固定，不進行干預。

1.6 取材

干預結束后次日，20%烏拉坦耳緣靜脈注射5 mL/kg麻醉兔，用采血管采集腹腔靜脈血，血液靜置30 min，3000 r/min離心10 min，血清置于EP管中，-20 ℃保存，用于ELISA檢測。采血后迅速摘取肝臟和脾臟，切取脾臟上端組織（1.5 cm×1 cm×0.2 cm）、肝右葉中段組織（2 cm×1 cm×1 cm），置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化檢測；再切取肝右葉中段組織（2 cm×1 cm×1 cm），置于凍存管中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.7 指標檢測

1.7.1 ELISA檢測

根據ELISA試劑盒說明書進行樣本稀釋、抗體孵育、底物顯色操作，酶標儀波長450 nm檢測樣品吸光度（OD值），計算血清IL-10、TIGIT、CD155含量。

1.7.2 Western blot檢測

提取肝組織總蛋白，進行蛋白定量。制膠，上樣（10 μg），電泳（80 V、60 min，120 V、60 min），轉膜（220 mA、100 min），5%BSA 4 ℃封閉2 h，加入JAK2、STAT3一抗（1∶2000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，顯影，成像。利用Image J軟件進行灰度分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.7.3 免疫組化檢測

取多聚甲醛固定的肝、脾組織，脫水、透明、浸蠟后包埋，制成蠟塊并切片，脫蠟，水化，抗原修復，封閉，滴加TIGIT一抗（1∶2000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶1000）孵育，脫水透明并封片。每張切片隨機取4個200倍視野拍照，采用Image Pro Plus 6.0軟件進行分析，計算陽性表達的平均光密度。

1.8 統計學方法

采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料滿足正態分布用±s表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。采用Pearson相關性分析對IL-10、TIGIT、CD155、JAK2、STAT3兩兩之間相關性進行評價，首先在SPSS中以散點圖判斷兩指標間是否存在線性回歸趨勢，如符合線性趨勢再進一步以最小二乘法建立擬合模型，并以相關系數（r）評價相關性。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隔藥餅灸對模型兔血清白細胞介素-10、TIGIT、CD155含量的影響

與空白組比較，模型組兔血清IL-10含量顯著減少，TIGIT、CD155含量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，艾條灸組和隔藥餅灸組兔血清IL-10含量顯著增加，TIGIT、CD155含量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比較（±s，pg/mL）

表1 各組兔血清IL-10、TIGIT、CD155含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組CD155194.15±6.97251.01±9.69**222.75±5.27##217.56±4.88##只數8888 IL-10489.02±62.21220.93±65.45**331.42±67.18##432.88±29.11##TIGIT 382.51± 4.48519.10±11.63**445.67± 8.57##445.70±10.95##

2.2 隔藥餅灸對模型兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，艾條灸組JAK2、STAT3蛋白表達有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），隔藥餅灸組肝組織JAK2、STAT3蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔肝組織JAK2、STAT3蛋白表達比較（±s，每組8只）

2.3 隔藥餅灸對模型兔肝組織和脾組織TIGIT表達的影響

肝組織TIGIT陽性表達主要在細胞膜及細胞質內，脾組織TIGIT陽性表達主要位于白髓動脈周圍淋巴鞘，多呈棕黃色。

與空白組比較，模型組兔肝組織和脾組織TIGIT表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，艾條灸組和隔藥餅灸組兔肝組織、脾組織TIGIT表達降低。見圖2、圖3、表2。

圖2 各組兔肝組織TIGIT陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖3 各組兔脾組織TIGIT陽性表達（免疫組化染色，×200）

表2 各組兔肝組織和脾組織TIGIT表達比較（±s，平均光密度）

表2 各組兔肝組織和脾組織TIGIT表達比較（±s，平均光密度）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

脾組織0.128921±0.017038 0.207435±0.020901**0.148481±0.031946##0.154947±0.014626##組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組只數8888肝組織0.078307±0.007597 0.129103±0.014293**0.090070±0.017162##0.092790±0.012536##

2.4 血清白細胞介素-10、TIGIT、CD1555與肝組織JAK2、STAT3相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示，血清IL-10與CD155（r=-0.68，P＜0.01）、TIGIT（r=-0.72，P＜0.01）含量呈負相關，與肝組織JAK2（r=0.73，P＜0.01）、STAT3（r=0.75，P＜0.01）表達呈正相關；血清CD155與TIGIT（r=0.61，P＜0.05）含量呈正相關，與肝組織JAK2（r=-0.84，P＜0.01）、STAT3（r=-0.86，P＜0.01）表達呈負相關；血清TIGIT與肝組織JAK2（r=-0.88，P＜0.01）、STAT3（r=-0.89，P＜0.01）表達呈負相關；肝組織JAK2與STAT3（r=0.98，P＜0.01）表達呈顯著正相關。見圖4。

圖4 血清IL-10、TIGIT、CD155與肝組織JAK2、STAT3 Pearson相關性分析（r）

3 討論

免疫抑制是指在機體在疾病或應激狀態下出現細胞因子表達或分泌異常的一種狀態。免疫抑制性因子活性增強，免疫活性細胞數目減少或亞群改變，免疫器官發生功能性和器質性改變，使機體防御能力下降。課題組前期研究表明，隔藥餅灸能通過六味地黃方、腧穴和艾灸的綜合作用，一定程度上改善免疫抑制引起的免疫器官、免疫細胞和免疫因子損傷[3]。

Breg是一類通過分泌多種細胞因子、調控T細胞及直接作用于惡性腫瘤細胞等多途徑發揮免疫抑制性作用的B細胞[6]。其發揮免疫抑制功能主要通過IL-10介導相關信號通路，影響下游效應基因發揮功能[7]，相關信號通路包括JAK2/STAT3信號通路和TIGIT/CD155信號通路等[8-9]。在對系統性紅斑狼瘡小鼠脾細胞的干預中發現，JAK2/STAT3信號通路活化能促進Breg分化和IL-10水平變化[10]。而對B細胞特異性缺失T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1基因的小鼠研究表明，高表達TIGIT和IL-10的Breg具有強免疫抑制作用[11]。并且有研究表明，TIGIT可能參與Breg相關反應[12]。因此，本研究圍繞與Breg相關的IL-10/JAK2/STAT3通路及TIGIT/CD155通路，觀察隔藥餅灸對免疫抑制的調節機制。結果表明，IL-10含量變化與JAK2/STAT3和TIGIT/CD155信號通路蛋白水平變化存在相關性，推測在免疫抑制模型中，存在Breg通過分泌IL-10介導JAK2/STAT3信號通路的調控機制，同時也可能影響TIGIT/CD155信號通路的變化，而隔藥餅灸能通過調節以上通路改善免疫抑制狀態。

JAK2/STAT3信號通路在腫瘤等免疫異常性疾病中發揮負向調控作用[13]，其水平變化與IL-10水平變化存在相關性，且IL-10水平變化會引起JAK2/STAT3信號通路下游分子變化，從而介導細胞增殖、凋亡及分化[14-15]。本研究相關性分析結果也表明，JAK2/STAT3信號通路蛋白表達水平與血清IL-10含量存在相關性，與上述研究結果一致。證明在免疫抑制狀態下，也存在IL-10水平變化引起的JAK2/STAT3信號通路蛋白表達的改變，且不同灸法干預呈現出差異性的調節結果，隔藥餅灸的干預效果優于艾條灸。

TIGIT是繼PD-1之后在腫瘤研究中的又一免疫檢查點受體，CD155是其下游蛋白，TIGIT/CD155信號通路能負向調控免疫反應[16]。免疫損傷模型研究表明，IL-10與TIGIT/CD155信號通路共同參與免疫負向調控作用[17]。免疫組化結果顯示，隔藥餅灸可以降低模型兔脾組織和肝組織TIGIT水平，改善機體免疫力。且在免疫抑制模型中IL-10水平變化與TIGIT/CD155信號通路蛋白表達水平的變化表現出一定的負相關性，推測受Breg介導的IL-10調控途徑與TIGIT調控途徑之間或許有共同調控模式。

脾為中樞免疫器官之一，含有大量淋巴細胞和巨噬細胞，是機體免疫細胞定居和免疫應答發生的場所。本課題組前期關于脾臟形態學的研究表明，隔藥餅灸能改善模型兔脾臟損傷[18]。同時，在黑虎掌菌子實體多糖干預環磷酰胺致小鼠免疫抑制實驗中，脾臟p-JAK2、p-STAT3蛋白水平與脾臟指數成反比，表明JAK2/STAT3信號通路與脾臟免疫功能的分子機制相關[19]。結合本研究關于脾臟TIGIT免疫組化結果顯示，脾臟TIGIT水平變化受模型兔脾臟免疫功能的影響，并且受影響程度與肝組織TIGIT變化水平一致，提示脾臟與肝臟所受調控機制可能一致。

以往對于JAK2/STAT3與TIGIT/CD155之間關系研究的報道較少，有關膀胱癌高通量分析的報告顯示，TIGIT與JAK2/STAT3存在高度相關性[20]。本研究通過對相關蛋白不同水平的檢測發現，兩者之間可能存在一定聯系，相關性分析結果也表明，TIGIT/CD155與JAK2/STAT3之間存在顯著負相關性，提示隔藥餅灸對共抑制分子TIGIT的調控可能有JAK2/STAT3通路的參與。

綜上，本研究在前期研究基礎上發現，隔藥餅灸改善免疫抑制兔免疫功能是在Breg作用的基礎上，通過IL-10介導的JAK2/STAT3通路完成的，該調控軸可能與TIGIT的參與有一定關系。但是本研究對于艾灸干預Breg的機制研究尚有不足，對TIGIT是否通過JAK2/STAT3通路調控細胞凋亡等途徑未作更深入的研究，這也是課題組今后的研究方向。