CCNA2在泛癌中的表達(dá)及其與預(yù)后和免疫浸潤的關(guān)系

王馨羚，肖瓊，付昱，孫晨蕊，李泓池，張步晨，宋永喜

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科，胃腸腫瘤精準(zhǔn)診療教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

細(xì)胞周期蛋白A2 （cyclin A2，CCNA2） 是細(xì)胞周期蛋白家族中高度保守的成員之一，同時(shí)也是細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老以及DNA復(fù)制和有絲分裂有關(guān)。作為一種新型致癌基因，CCNA2在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長和凋亡中起作用，敲低CCNA2可以減緩細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制相關(guān)癌細(xì)胞的生長，其在癌癥轉(zhuǎn)化和進(jìn)展中也有潛在作用［1-2］。近年研究［3］表明，CCNA2過表達(dá)與某些癌癥的預(yù)后不良有關(guān)，如肺腺癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌等。

越來越多的腫瘤研究［4］發(fā)現(xiàn)，CCNA2可作為腫瘤免疫微環(huán)境的潛在標(biāo)志物。CCNA2在多種癌癥中的表達(dá)與部分腫瘤殺傷免疫細(xì)胞的活化存在顯著相關(guān)性。以結(jié)腸癌為例，CCNA2在腫瘤組織中表達(dá)較高，且在腫瘤微環(huán)境中正向調(diào)節(jié)腫瘤殺傷免疫細(xì)胞，有助于激活CD8+T細(xì)胞，使CD8+T細(xì)胞發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用，從而延長結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間［5］。此外，CCNA2能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，CCNA2高表達(dá)的腫瘤中M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平更高［6］。因此，本研究綜合分析了33種腫瘤中CCNA2的表達(dá)水平，旨在探究CCNA2與腫瘤預(yù)后及免疫浸潤的相關(guān)性，從而為癌癥治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 資料來源

從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫 （http：//xena.ucsc.edu/） 下載癌癥基因組圖譜計(jì)劃 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫中33種腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù) （10 557例）、體細(xì)胞突變數(shù)據(jù) （10 380例） 以及臨床生存數(shù)據(jù)（13 694例）。通過R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，根據(jù)預(yù)后隨訪信息的完整程度篩選臨床生存數(shù)據(jù)，將其中缺失生存狀態(tài)、生存時(shí)間為0的患者信息剔除。

1.2 基因表達(dá)分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取33種腫瘤中CCNA2表達(dá)的每百萬測序堿基中基因外顯子每千個(gè)堿基長度中所包含的測序片段數(shù) （fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，F(xiàn)PKM），形成表達(dá)矩陣，通過患者ID匹配表達(dá)矩陣和臨床信息。為了比較癌癥樣本和相鄰正常樣本的基因表達(dá)水平，對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)。

1.3 生存分析

使用單因素Cox回歸模型，分析CCNA2的表達(dá)水平與總體生存率的相關(guān)性，計(jì)算95%CI的風(fēng)險(xiǎn)比。

1.4 免疫浸潤分析

腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的數(shù)據(jù)庫 （tumor-immune system interactions database，TISIDB，http：//cis.hku.hk/TISIDB/）［7］是一個(gè)腫瘤和免疫系統(tǒng)交互的門戶網(wǎng)站。本研究利用TISIDB數(shù)據(jù)庫分析不同類型腫瘤中CCNA2表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的相關(guān)性。

1.5 功能富集分析

基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析 （Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA） 數(shù)據(jù)庫 （http：//gepia.cancer-pku.cn/）［8］是一個(gè)基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析的在線網(wǎng)站。本研究通過GEPIA2中的“Similar Genes Detection”篩選出相關(guān)性排名前100的基因，繪制前6個(gè)代表性基因的散點(diǎn)圖。注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫 （Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）［9］是一個(gè)常見的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，用于基因列表功能注釋和富集分析。本研究通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)CCNA2共表達(dá)基因進(jìn)行基因本體 （Gene Ontology，GO） 和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 富集分析，GO通過生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)層面進(jìn)行分析，KEGG對(duì)基因集進(jìn)行信號(hào)通路分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件 （版本4.1.2） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，應(yīng)用Spearman相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析，應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCNA2在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)水平

本研究納入TCGA數(shù)據(jù)庫中33種腫瘤組織中CCNA2的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中24種腫瘤組織有相應(yīng)的正常組織，作為對(duì)照。利用配對(duì)Wilcoxon檢驗(yàn)分析腫瘤組織與正常組織中CCNA2的表達(dá)差異 （圖1），結(jié)果表明，CCNA2在17種腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織 （P< 0.001），如膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、結(jié)腸癌。

圖1 CCNA2在33種腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of CCNA2 in 33 cancer and normal tissues

2.2 CCNA2表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性

分析不同腫瘤中CCNA2表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性 （圖2），結(jié)果表明，在食管癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞性肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、乳腺浸潤癌中，CCNA2表達(dá)隨著TNM分期的增加而升高；而在皮膚黑色素瘤和結(jié)腸癌中，CCNA2表達(dá)隨TNM分期的增加而降低。

圖2 不同腫瘤中CCNA2表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性Fig.2 Correlation between CCNA2 expression level and clinical stage in different cancer types

2.3 CCNA2在泛癌中的預(yù)后價(jià)值

通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析得出CCNA2在33種腫瘤中的預(yù)后森林圖 （圖3），結(jié)果表明，CCNA2高表達(dá)是多種腫瘤的危險(xiǎn)因素，包括腎上腺皮質(zhì)癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、間皮瘤和胰腺癌 （P<0.001），而CCNA2高表達(dá)是胸腺瘤 （P= 0.012） 的保護(hù)因素。

圖3 CCNA2表達(dá)與33種腫瘤總體生存率的關(guān)系Fig.3 Relationship between CCNA2 expression and overall survival in 33 cancer types

2.4 CCNA2表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性

腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的數(shù)量和活性狀態(tài)是腫瘤預(yù)后的重要預(yù)測指標(biāo)［10］。應(yīng)用TISIDB數(shù)據(jù)庫分析CCNA2的表達(dá)量與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的相關(guān)性。熱圖 （圖4A） 顯示，CCNA2與ACT-CD4淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)的相關(guān)性。其中，在腎細(xì)胞癌 （r= 0.705，P< 0.001）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤 （r= 0.704，P< 0.001）、肺腺癌 （r=0.664，P< 0.001） 中CCNA2與ACT-CD4淋巴細(xì)胞顯著相關(guān) （圖4B～4D）。這表明CCNA2可能影響這些免疫檢查點(diǎn) （immune checkpoint，ICP） 基因的表達(dá)，并有望成為理想的免疫治療靶點(diǎn)。

圖4 TISIDB數(shù)據(jù)庫中CCNA2表達(dá)與淋巴細(xì)胞的相關(guān)性Fig.4 Correlation between CCNA2 expression and lymphocyte infiltration in TISIDB database

2.5 CCNA2表達(dá)與ICP基因的相關(guān)性

ICP基因異常表達(dá)是眾所周知的腫瘤免疫逃逸機(jī)制［11］。本研究分析了CCNA2表達(dá)與ICP基因的相關(guān)性 （圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，47個(gè)ICP基因在多種腫瘤中與CCNA2表達(dá)強(qiáng)相關(guān)。特別是在甲狀腺癌中，共46個(gè)ICP基因與CCNA2表達(dá)有關(guān) （P< 0.05）。提示CCNA2可協(xié)調(diào)這些ICP基因的活性，并作為理想的免疫治療靶點(diǎn)。

圖5 泛癌中CCNA2表達(dá)與ICP基因的相關(guān)性Fig.5 Correlation between CCNA2 expression and immune checkpoint genes in 33 pan-cancer

2.6 CCNA2表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性

腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性經(jīng)常在腫瘤免疫治療研究中作為預(yù)測性免疫標(biāo)志物的指標(biāo)［12］。本研究評(píng)估了腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與CCNA2表達(dá)的相關(guān)性。通過分析CCNA2在不同腫瘤中的突變數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在15種腫瘤中，CCNA2的表達(dá)水平與腫瘤突變負(fù)荷呈正相關(guān)，而在胸腺瘤中與腫瘤突變負(fù)荷呈負(fù)相關(guān) （圖6A）；在9種腫瘤中，CCNA2的表達(dá)水平與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性呈正相關(guān)，而在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、急性髓系白血病、皮膚黑色素瘤中與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān) （圖6B）。

圖6 不同腫瘤中CCNA2表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系Fig.6 Correlation between CCNA2 expression and tumor mutational burden and microsatellite instability in different cancer types

2.7 CCNA2表達(dá)與功能富集分析

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析100個(gè)CCNA2的相關(guān)基因，其中6個(gè)代表性靶基因 （MAD2L1、PLK1、PLK4、KIF11、CCNB2、BUB1） 的表達(dá)量與CCNA2的表達(dá)量在多種腫瘤中顯著正相關(guān) （圖7A～7F）。應(yīng)用R軟件對(duì)CCNA2及其相關(guān)基因進(jìn)行富集分析 （圖7G～7H）。GO分析結(jié)果表明，CCNA2及其相關(guān)基因在腫瘤中主要與細(xì)胞分裂、細(xì)胞核、蛋白質(zhì)結(jié)合等功能有關(guān)。KEGG分析結(jié)果表明，基因明顯富集在細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號(hào)通路。

圖7 CCNA2在腫瘤中相關(guān)基因的功能富集分析Fig.7 Functional enrichment analysis of CCNA2-related genes in tumors

3 討論

CCNA2是細(xì)胞周期蛋白家族中的成員之一。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可通過與不同的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的結(jié)合，參與控制G2/M期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變和S期進(jìn)展。研究［13］表明，CCNA2表達(dá)是肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌預(yù)后模型的重要組成部分，與多種差異表達(dá)蛋白相互作用，被認(rèn)為是多種腫瘤的核心基因。本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的33種腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)CCNA2在不同腫瘤中的表達(dá)存在差異，且多種CCNA2高表達(dá)的腫瘤預(yù)后較差，這說明CCNA2可作為一個(gè)腫瘤臨床預(yù)后指標(biāo)。

近年的研究表明，CCNA2在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，主要包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞和相關(guān)分子物質(zhì)。腫瘤免疫微環(huán)境是免疫治療的重要生物標(biāo)志物，與腫瘤免疫逃逸機(jī)制息息相關(guān)［10］。研究［3］表明，CCNA2表達(dá)與CD4+T細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)，可能參與腫瘤免疫微環(huán)境的重塑，為腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。此外，XU等［6］的研究證實(shí)了CCNA2可以激活巨噬細(xì)胞，從而增強(qiáng)腫瘤免疫浸潤水平，提示CCNA2在免疫治療中具有重要作用。本研究通過對(duì)CCNA2表達(dá)與免疫浸潤進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)CCNA2表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境具有相關(guān)性，可作為腫瘤免疫治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是2種被廣泛研究的生物標(biāo)志物，可被用于腫瘤免疫治療研究中。研究［14］表明，低腫瘤突變負(fù)荷的頸部鱗狀細(xì)胞癌患者比高腫瘤突變負(fù)荷患者的預(yù)后更好，腫瘤突變負(fù)荷可影響B(tài)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞浸潤，說明腫瘤突變負(fù)荷可能對(duì)腫瘤患者的預(yù)后和免疫浸潤有一定影響。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可發(fā)生于多種腫瘤中，如子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、胃癌等。隨著微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測技術(shù)和免疫抑制劑在腫瘤治療中的發(fā)展，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤患者對(duì)免疫治療反應(yīng)良好［15］。本研究通過對(duì)基因突變數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CCNA2表達(dá)在多種腫瘤中與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性具有相關(guān)性。本研究為CCNA2與腫瘤免疫浸潤的相關(guān)性提供了有利的線索。

本研究分析了多種腫瘤中CCNA2與預(yù)后、免疫浸潤、腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等因素的相關(guān)性。雖然本研究對(duì)于CCNA2的泛癌研究結(jié)合了多個(gè)數(shù)據(jù)庫中的信息，但仍具有局限性：（1） 本研究仍停留在理論層面上，且得到的分析結(jié)果可能存在系統(tǒng)誤差，仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；（2） 本研究發(fā)現(xiàn)CCNA2的表達(dá)水平可能與腫瘤的免疫微環(huán)境和生存率相關(guān)，但仍不確定CCNA2是否通過免疫途徑影響生存率。

綜上所述，本研究闡明了CCNA2的表達(dá)水平與多種腫瘤的預(yù)后有關(guān)，且與腫瘤中不同程度的免疫浸潤有關(guān)，進(jìn)一步揭示了CCNA2作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)生物標(biāo)志物的潛力。因此，進(jìn)行CCNA2與腫瘤免疫微環(huán)境的前瞻性研究具有重要意義，能夠?yàn)槲磥淼拿庖咧委熖峁┬碌囊罁?jù)。