基于網絡藥理學探究香砂枳術丸治療功能性消化不良的作用機制與實驗驗證

李雪巖 羅志強 韓 星 楊文寧 陳洪嬌 江曉泉 森慕黎 汪國鵬 劉 洋

(1 北京中醫藥大學中藥學院,北京,102488; 2 北京中醫藥大學生命科學學院,北京,102488;3 中財瀚熙〔北京〕生物科技發展有限公司,北京,101503)

香砂枳術丸,最早出自《景岳全書》,由枳實、白術、砂仁和木香組成,是《中華人民共和國藥典》收載的基本藥物。其中木香為君藥,枳實為臣藥,具有健脾開胃、順氣寬胸、行氣消痞的功效,可用于脘腹疼痛、食欲不振、脾虛氣滯等癥。現代藥理研究表明,此制劑具有調節胃腸運動,促進消化的功能,現常用于治療功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD),療效較為顯著[1-3]。

FD是臨床消化系統的常見病癥,據流行病學統計,全球范圍內FD患病率為10%～30%,其中亞洲人群患病率8%～23%,且有升高的趨勢,嚴重影響了人們的生命質量[4-5]。目前,西醫暫沒有明確針對FD的藥物,而中藥具有多成分、多靶點、多通路的優勢,通過明確疾病的病因、病機和辨證論治,可有效地緩解癥狀、降低復發率,極大地提高患者的康復率。

“網絡藥理學”最早由英國藥理學家HOPKINS于2007年提出[6],研究者可從生物信息學和系統生物學的角度,整體研究中藥復方的藥理作用機制,這與中藥整體觀的思路不謀而合。

中藥復方是按照配伍規律將多種不同中藥按一定比例組合而成的一種經典給藥形式,在我國醫療體系中發揮著重要的作用。然而由于中藥復方所涉及的成分較為復雜、靶點眾多,而且缺乏探索中藥復方組合規律的方法,難以完全闡釋中藥復方防病、治病的作用機制。ZHANG等[7]通過構建網絡藥理學平臺,以清絡飲為研究對象,揭示了其抗類風濕性關節炎的炎癥反應和免疫反應等關鍵過程,為日后對中藥復方深入系統研究提供了理論參考。基于網絡藥理學的理論,逍遙散、四妙丸、桃紅四物湯等經典中藥復方治療慢性疾病的作用機制逐漸被揭示并得到證實[8-11]。因此,本文以網絡藥理學的研究思路,結合分子對接,探索中藥復方制劑香砂枳術丸對治療FD的潛在作用機制,為其實驗研究提供理論依據與參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數據分析平臺及軟件 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php);中藥分子機制生物信息學分析工具(Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm);Perl語言;在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org);UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org/);治療靶點數據庫(Therapeutic Target Database,TTD,https://www.db.idrblab.org/ttd/);Drug Bank數據庫(https://www.drugbank.ca/);GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/);STRING數據庫(http://string-db.org/);Cytoscape軟件;MOE軟件;RCS PDB數據庫(http://www.rcsb.org/);DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)。

TCMSP是由西北大學計算生物學實驗室建立的中草藥系統藥理學平臺,包括是《中華人民共和國藥典》注冊的499種中藥及化合物(共計30 000余個),是網絡藥理學常用的分析平臺[12]。通過在“Herb name”項下分別輸入4味中藥進行檢索活性成分,并且以影響藥效的關鍵參數類藥性(Drug Likeness,DL)和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)作為篩選條件[13],最小值分別設定為0.18和30%得到活性成分。BATMAN-TCM是國內首個基于網絡藥理學研究中藥分子機制的在線生信研究平臺,可實現中藥及復方成分和靶點的預測和分析[14]。通過在“Formula”項下輸入“XIANG SHA ZHI ZHU WAN”,將“Score cutoff”設定為30,建立活性成分數據庫。

1.1.2 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠,雄性,7周齡,體質量約220 g,購于北京斯貝福生物技術有限公司,實驗動物生產許可合格證號:SCXF(京)2019-001,適應性飼養7 d,溫度25～27 ℃,相對濕度50%～70%,實驗前12 h禁食不禁水，嚴格遵循北京中醫藥大學倫理部的倫理標準(倫理審批號：BUCM-4-2022061501-2061)。

1.1.3 藥物 香砂枳術丸(安徽亳州,批號:2023-3-15);多潘立酮(西安楊森制藥有限公司,批號:MKJOX54)。

1.1.4 試劑與儀器 活性炭粉(天津市登峰化學試劑廠,批號:20221223);羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20200713);蔗糖(西隴科學股份有限公司,批號:2105062);氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司,批號:2206081907);大鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)試劑盒,大鼠血管活性腸肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)試劑盒,大鼠白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)試劑盒(北京冬歌博業生物科技有限公司,貨號:DG20153D,DG20146D,DG94490Q)。酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司,美國,型號:MultiSkan FC);超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ5200E);電子分析天平(Sartorius公司,德國,BSA2202S);高速冷凍離心機(Sigma離心機,德國,型號:1-15PK)。

1.2 方法

1.2.1 香砂枳術丸活性成分靶點的篩選 分別在TCMSP和BATMAN-TCM平臺篩選活性成分相關靶點,使用Perl語言和UniProt進行靶點標準化,將Organism設置為“Homo sapiens(Human)”,統一使用UniProt ID表示,建立成分靶點數據庫。

1.2.2 FD靶點的篩選 以“Functional Dyspepsia”為檢索關鍵詞,分別在TTD、Drug Bank、OMIM和GeneCards這4個國際認可的基因組數據庫獲取疾病靶點,建立疾病靶點數據庫。

1.2.3 “中藥復方-活性成分-作用靶點”網絡構建 Cytoscape是一款能圖形化顯示數據并可數據分析的可視化軟件,將獲取的活性成分與靶點導入,構建“中藥復方-活性成分-作用靶點”的藥物靶點相互作用網絡,用于探究香砂枳術丸治療FD的藥理學作用機制。

1.2.4 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡構建 為了明確藥物靶點與疾病靶點之間的相互關系,將活性成分靶點與疾病靶點分別導入STRING數據庫,將“Organism”項下設置為“Homo sapiens(Human)”,分別構建活性成分靶點和疾病靶點的PPI網絡圖。

1.2.5 核心靶點篩選 將“1.2.4”項下網絡導入Cytoscape,使用“Merge”功能并借助Network Analyzer分析網絡,選取度值(Degree)大于2倍中位數的靶點作為候選核心靶點。采用CytoNCA插件對候選核心靶點進行網絡拓撲學分析。以接近中心性(Closeness Centrality,CC)和介度中心性(Betweeness Centrality,BC)為標準,篩選標準為大于1倍中位數。符合標準的靶點即可作為核心靶點進行生物信息學分析。

1.2.6 生物信息學分析 將核心靶點輸入DAVID,使用“Functional Annotation”功能,將“Gene List Manager”和“Population Manager”項下均設置為“Homo sapiens”后進行生信學分析。查看Gene Ontology項下的細胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)、生物過程(Biological Process,BP)進行GO富集分析;依據P-Value和通路基因富集數進行KEGG富集分析。

1.2.7 分子對接驗證 從RCSB PDB蛋白數據庫獲取核心靶點度值最大的2個靶點INS(PDB ID:1TYL)、AKT1(PDB ID:3BDY)的3D結構及自帶配體,選取物種為“Homo sapiens”;收集75個活性成分的3D結構,使用MOE對接軟件對靶蛋白預處理,分子對接后通過打分值評價活性成分、自帶配體與靶點結合活性大小,驗證上述網絡分析的結果。

1.3 實驗分析

1.3.1 分組與模型制備 將30只SD大鼠通過隨機數字表分成空白組、模型組、香砂枳術丸組和多潘立酮組,每組6只。除空白組外,其余各組采用不規則喂養和夾尾刺激法建立FD大鼠模型:大鼠正常飲水,隔日禁食,每天用長海綿鉗夾大鼠尾部遠端約1/3處,0.5 h/次,每隔3 h刺激1次,4次/d,連續7 d。造模結束后,恢復正常的飲食和飲水。

1.3.2 給藥方法 各給藥組分別灌胃相應香砂枳術丸(7.2 g/kg)與多潘立酮混懸液(9×10-3g/kg),空白組和模型組灌胃等體積(3 mL)生理鹽水,2次/d,連續14 d。

1.3.3 檢測指標與方法 一般行為學觀察:對實驗過程中各組大鼠的食物攝入量、飲水量、體質量、活動度、毛發、糞便等進行觀察和評估。

炭末推進實驗:大鼠最后1次給藥后,禁食不禁水后灌胃炭末液,30 min后腹主動脈取血處死,用直尺測量小腸全長以及炭末達最前端的距離,計算大鼠小腸炭末推進率(炭末推進距離/小腸全長×100%)。

大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT含量檢測:大鼠腹主動脈取血后,靜置20 min,離心機以3 500 r/min,離心半徑10 cm,離心15 min取上層血清,按照試劑盒說明書中步驟使用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)測定上述藥效學指標。

2 結果

2.1 活性成分及靶點篩選結果 TCMSP和BATMAN-TCM共篩得活性成分75個,其中白術中化合物7個;砂仁中化合物24個,枳實中化合物33個;木香中化合物9個;共有成分有2個;共得到靶點292個。見表1。

2.2 FD疾病靶點篩選結果 共篩選得到FD疾病靶點666個。見表2。

表2 香砂枳術丸對大鼠體質量增量的影響

表2 疾病靶點統計(個)

2.3 “中藥復方-活性成分-作用靶點”網絡構建 構建的“中藥復方-活性成分-作用靶點”網絡共包括371個網絡節點和1 353條邊,在篩選得到的292個靶點中,60%以上的靶點至少與2個化合物發生相互作用,而且不同的活性成分也作用于相同的靶點。此外,前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受體(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受體1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此網絡中是度值前3的靶點,與20個以上的化合物發生相互作用。PTGS2,又稱之為環氧合酶(Cyclooxygenase,COX)在網絡中度值最高。見圖1。

圖1 “中藥復方-活性成分-作用靶點”網絡

2.4 PPI網絡構建 活性成分靶點PPI網絡獲得節點288個,PPI網絡邊有3 400條;疾病靶點PPI網絡獲得節點587個,PPI網絡邊有16 922條,用于下一步核心靶點的選擇。

2.5 核心靶點篩選結果 絡拓撲分析結果表明BC和CC的中位數值分別為0.002和0.491,故使用BC>0.002和CC>0.491為篩選條件獲取核心靶點,最終獲取核心靶點90個。隨著度值增大,節點的大小與顏色逐漸加深,位于中心的節點為度值最大的節點。見圖2～3。

圖2 核心靶點篩選流程及結果

圖3 核心靶點網絡

2.6 生物信息學分析結果 香砂枳術丸在治療FD的分子功能主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控(Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、基因表達正調控(Positive Regulation of Gene Expression)、凋亡過程的負調控(Negative Regulation of Apoptotic Process)、DNA轉錄的正調控(Positive Regulation of Transcription,DNA-templated)等。生物過程主要富集在同源蛋白結合(Identical Protein Binding)、酶結合(Enzyme Binding)、蛋白結合(Protein Binding)、轉錄因子結合(Transcription Factor Binding)、生長因子活性(Growth Factor Activity)等。細胞組分主要位于細胞外空間(Extracellular Space)、胞外區(Extracellular Region)、細胞溶質(Cytosol)、蛋白復合體(Protein Complex)、細胞質核周區(Perinuclear Region of Cytoplasm)等。

香砂枳術丸治療FD的藥理作用機制主要涉及癌癥通路(Pathways in Cancer)、細胞凋亡通路、炎癥通路等,如PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT Pathway)、缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號通路、叉頭盒O(Forkhead box O,FoxO)蛋白信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信號通路等。

2.7 分子對接 對接分數顯示,75個活性成分中有90%以上的成分與INS、AKT1對接分數大于陽性參照物。見圖4～5。

圖4 INS與MS-2分子對接

圖5 AKT1與MS-1分子對接

2.8 大鼠一般情況 通過觀察發現,與空白組比較,模型組大鼠普遍出現活動減緩,活躍度降低,毛發少亂,枯黃,易怒和打斗,進食量和進水量逐漸減少,大便變干,可認定造模成功。香砂枳術丸組和多潘立酮組大鼠的體質量增量顯著高于模型組大鼠,差異有統計學意義(P<0.05),且與空白組大鼠增長幅度接近。見表2。

2.9 香砂枳術丸對大鼠炭末推進率的影響 與空白組比較,模型組的炭末推進率差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,香砂枳術丸組與多潘立酮組的炭末推進率有所上升,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 香砂枳術丸對大鼠炭末推進率的影響

2.10 香砂枳術丸對大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT的影響 與空白組比較,模型組大鼠血清IL-6和VIP含量顯著升高,血清中5-HT含量下降,差異均有統計學意義(均P<0.05);與模型組比較,香砂枳術丸組與多潘立酮組大鼠血清的IL-6和VIP含量顯著下降,血清中5-HT含量顯著提高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖6～8。

圖6 香砂枳術丸對大鼠血清IL-6的影響

圖7 香砂枳術丸對大鼠血清VIP的影響

圖8 香砂枳術丸對大鼠血清5-HT的影響

3 討論

DAVID是一個基于基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數據庫的高通量生物信息平臺,整合了各種生物學數據(如大量的基因序列和蛋白列表)和分析工具,可以系統全面地提供生物學信息[15]。

“中藥復方-活性成分-作用靶點”網絡構建表明中藥復方在治療疾病方面具有多成分、多靶點的協同治療作用,而不是僅僅作用于某一個靶蛋白,符合中醫藥整體觀的治療原則。此外,前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受體(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受體1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此網絡中是度值前3的靶點,與20個以上的化合物發生相互作用[16]。表明其結合活性良好,也證明此次網絡藥理學研究的預測結果具有可靠性,可為日后的分子生物學研究提供有價值的參考。

本研究使用網絡藥理學的方法,探究了香砂枳術丸治療FD的作用機制。首先分析了復方的活性成分,并使用Cyctoscape構建了活性成分與靶點的網絡圖,證明此復方協同治療作用。同時選取了此網絡度值最高的3個靶點,認為這些節點在治療FD中具有重要作用。經多次篩選得出核心靶點后,這3個靶點仍涵蓋其中,且度值較高,也證明其治療疾病時的重要性。借助GO和KEGG分析,從生物信息學的角度對核心靶點進行富集研究。最后使用分子對接,對本研究的結果進行驗證。

白術作為補氣健脾第一要藥,臨床多用于治療胃腸道疾病,實驗證明白術炮制后,白術內酯含量出現顯著升高,而其含有的揮發油成分,如蒼術酮,與生品比較有所下降[17-18]。藥理研究表明,白術的水煎液對于大鼠胃腸道具有雙向調節作用,馬曉松等[19]以實驗豚鼠為研究對象,初步研究了不同濃度白術水煎液對于動物胃腸運動的影響,為白術對于便秘以及泄瀉的治療提供了理論基礎。白術所含的內酯類成分還可以對抗炎癥介質,抑制IL-6、TNF的表達,能減輕胃黏膜損傷[20]。

生品枳實,具有很強的破氣作用,藥理研究表明,其有效成分辛弗林、新橙皮苷以及柚皮苷對于脾虛大鼠胃腸道有顯著的促進作用,具體機制與促進胃腸道激素分泌有關[21]。另有研究證明,枳實的水提取液可通過上調5-HT受體4以及神經絲蛋白H促進神經叢修復,進而緩解慢性傳輸型便秘[22]。麩炒后可增加柚皮苷等黃酮類化合物的溶解度和脂溶性,進而能使藥物利于透過細胞膜增加藥物吸收,增加對于胃腸道的作用[23]。木香,用于脘腹脹痛、食積不消等癥狀,具有代表性的成分如木香烴內酯和去氫木香內酯[24]。研究證實,木香顯著改善乙醇所導致的小鼠胃潰瘍的形成,其作用機制與改善細胞氧化應激反應,促進細胞的增殖有關,此研究為木香作為胃腸道保護藥提供了新的理論基礎[25]。砂仁多含有揮發油成分如異龍腦、樟腦,研究證明,揮發油成分是對胃黏膜保護的主要成分[26]。

根據最新的羅馬Ⅳ標準,FD癥狀起源于胃、十二指腸,主要癥狀表現為早飽感、餐后腹脹,上腹痛及上腹部燒灼感。根據不同臨床表現,具體可以分為上腹痛綜合征和餐后不適綜合征2種[27]。我國各種來源的經典古籍之中并沒有關于FD的記載,但可以根據臨床表現將其歸為痞滿。“痞滿”一詞,首見于《黃帝內經》:“心胃生寒,胸膈不利,心痛痞滿,頭痛善悲。”中醫認為FD多在肝脾不和,導致肝氣郁結、脾胃虛弱,故治療關鍵在于健脾開胃,行氣消痞,此疾病的發病原因在于幽門螺桿菌導致感染、腦-腸軸紊亂、胃腸動力異常、內臟高敏感性等[28-29]。

PI3K-AKT信號通路是一類較為經典的信號轉導通路,可以調節不同的細胞功能,例如細胞生長、代謝、存活以及合成等方面發揮著重要的作用[30]。此通路與胃黏膜細胞具有很強關聯性,可以參與上皮細胞的生長,與上皮細胞存活直接相關[31]。在FD病情中,會出現腹部疼痛的癥狀,這與胃酸異常分泌損傷胃黏膜上皮細胞有關,而胃黏膜具有抑制胃液中氫離子滲透的作用[32]。在PI3K-AKT信號通路上,通過生長因子或信號轉導復合物激活PI3K,產生信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(Phosphatidyl-inositol,3,4,5 Triphosphate,PIP3),逐步使本通路的核心分子AKT被激活,進而調節其下游靶點在胃組織的表達,促進胃黏膜上皮細胞再生。與PI3K-AKT信號通路類似,FoxO信號通路在細胞凋亡中也發揮了較為重要的作用,FoxO在細胞質中合成,后進入細胞核中誘導細胞的凋亡。近期有研究表明,FoxO信號通路與幽門螺桿菌所致的胃黏膜細胞凋亡有關,具體作用機制可能是通過此通路對胃黏膜上的細胞進行調控[33]。

核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號通路雖未出現在所展示富集基因數更多的通路中,但是也具有很高的顯著性(P<0.01)。作為PI3K-AKT下游通路,通過TNF、IL等細胞因子激活后,可在細胞凋亡、生長等方面發揮重要作用。目前有研究表明,NF-κB信號通路的激活與幽門螺桿菌感染的發生具有相關性,當胃腸道感染幽門螺桿菌后,會損傷胃黏膜,嚴重者還會誘發癌癥的發生,通過分析關鍵靶點及其在通路的富集情況,推測機制可能通過調控表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF),IL-6進而抑制幽門螺桿菌感染,減輕炎癥反應。

在關于FD的靶點中,腦-腸軸一直被認為是一個關鍵治療靶點,其在人體代謝中也發揮著一定的作用,例如糖尿病以及肥胖的發生[34]。腦-腸神經細胞受到來自中樞、腸道、自主神經的調節,通過釋放相關腦-腸肽(胃腸道激素)進而維持其穩定健康運行,相關腦-腸肽激素水平的異常升高或者降低都是引發功能性消化不良的主要誘因之一[35-37]。從中醫角度來說,肝氣犯胃,引起腹痛、腹脹以及便秘等胃腸道相關的不良反應,相應的治療方案即為行氣健脾開胃,證明中醫在很早就對腦-腸軸這一概念有所研究。本復方中的白術、枳實、木香的水提液均可以起到一定的行氣作用。從通路的角度來看,神經營養因子信號通路(Neurotrophin Signaling Pathway)是一類與神經細胞分化和存活有關的營養因子的通路,家族中包括神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、腦源性神經營養因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神經營養因子(Neurotrophin,NT)-3和NT-4。此通路可以連接多種細胞內信號級聯,包括MAPK通路、PI3K-AKT信號通路。FD患者可以通過激活此通路,將本來異常的腸神經系統以腦-腸軸的作用機制進行調節,降低腸道的高敏感性,使得神經因子恢復為正常的狀態。與此同時,抑制NF-κB信號通路,減少炎癥介質的釋放,進一步調節患者的心理因素,二者發揮協同作用達到神經調節的效果[34]。動物實驗也表明,香砂枳術丸可以顯著調節FD大鼠體內IL-6、VIP以及5-HT的含量,顯示其可以通過影響NF-κB、NT等通路上的關鍵靶點發揮藥效,也從一定程度上證明了網絡藥理學研究的可靠性,可為日后的深入藥效學研究提供研究思路。

值得注意的是,除了富集這些通路外,關鍵靶點還富集到癌癥通路。FD的其中一個重要病因即為幽門螺桿菌的感染,現已有研究表明,幽門螺桿菌是胃癌的重要啟動子,與癌癥某些基因的表達有顯著相關性,并且是造成胃癌的重要原因之一[38]。癌癥通路的富集,推測此復方具有降低幽門螺桿菌誘發胃癌發病率的潛力。

綜上所述,本研究認為,香砂枳術丸治療FD的作用機制主要在于PI3K-AKT信號通路、FoxO信號通路、NF-κB信號通路、NT信號通路這4條通路,分別對體內幽門螺桿菌導致感染、腦-腸軸紊亂以及內臟高敏感性進行調控,以達到治愈功能性消化不良的目的。

利益沖突聲明:無。