蒼耳子散治療季節性變應性鼻炎的藥理實驗與作用機制研究變應性鼻炎

王宇婷 李金飛 徐文龍 劉薈菁 王嘉璽

(1 北京中醫藥大學東方醫院,北京,100078; 2 北京中醫藥大學東直門醫院通州院區,北京,101100; 3 大興區婦幼保健院,北京,102600)

季節性變應性鼻炎(Seasonal Allergic Rhinitis,SAR)是IgE介導的Ⅰ型變態反應,表現為季節性反復發作的鼻塞、噴嚏、流清涕等癥狀,為臨床常見病。SAR發病率與空氣中PM 2.5濃度正相關[1]。治療方面,中醫藥在延緩發作頻率和減少發作癥狀上有獨特的優勢[2]。

蒼耳子散作為中醫治療SAR的傳統經典名方,其作用機制值得深入挖掘與研究。中藥復方的作用機制具有多靶點、多層次、范圍廣的優勢。網絡藥理學是基于多學科理論基礎,除醫學、生物學外,包括計算機科學、生物信息學等,并整合多種研究手段而形成的研究方法[3]。應用網絡藥理學對中藥復方作用機制進行研究,有助于揭示中藥復方科學內涵、發現作用靶點、為實驗驗證中藥復方治療的靶點提供方向。

1 資料與方法

1.1 蒼耳子散相關靶點基因篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中,設置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18,對化合物在動物體內的毒藥物動力學特征——吸收、分布、代謝和排泄(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME)進行初篩，查找4味中藥活性成分[4]。為標準化蛋白質靶點信息，統一在UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org)對化合物作用的蛋白質靶點進行規范。同時根據已發表的文獻報告補充未預測到的活性化合物的已知靶點。

1.2 蒼耳子散藥物活性成分與靶點網絡構建 應用Cytoscape 3.7.2圖像化軟件對生物活性成分及作用靶點進行相關網絡構建,其中用“節點(Node)”表示蒼耳子散藥物組成、活性成分、作用靶點,用“邊(Edge)”表示節點之間的關系[5]。同時應用相關插件進行網絡特征分析,以明確蒼耳子散中關鍵活性成分和作用靶點,最終目的為結合文獻分析其中的相互作用。

1.3 SAR相關靶基因篩選 以“seasonal allergic rhinitis”“SAR”為關鍵詞在人類基因信息數據庫(GeneCards,http://www,genecards.org)中篩選SAR相關作用靶點。并根據經驗設定Score大于中位數的目標靶點為SAR的潛在靶點。

1.4 蒼耳子散活性成分-SAR靶點蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡構建 通過PPI數據的構建與挖掘,建立靶點的直接、間接調控作用關系網絡,從而更清晰地呈現藥物活性成分與靶點間的結合形式及重要節點的挖掘。

為探究蒼耳子散組方相關靶點與SAR靶點間的相互作用,首先應用CytoScape 3.7.2中Bisogenet插件分別對2組靶點進行PPI網絡構建,將生物種類設定為“Homo sapiens”,身份識別導出類型設定為“gene identifiers only”,其余設置均為默認設置,得到PPI網絡之后應用merge工具對2組PPI進行融合構建PPI網絡。通過網絡拓撲分析插件CytoNCA并結合相關文獻,連接度中心性(Degree Centrality,DC)、介度中心性(Betweenness Centrality,BC)、緊密中心性(Closeness Centrality,CC)、網絡中心性(Network Centrality,NC)和局部邊連通性(Localaverage Connectivity,LAC)等指標進行篩選,其中DC值大于所有節點DC值中位數2倍的節點為網絡中的重要節點(Hubnodes)。再篩選其他幾個指標中大于中位數的節點,即關鍵靶點。將關鍵靶點提交至STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)構建PPI網絡模型,分析其參與的生物過程,并對其功能進行描述[6]。

1.5 相關靶點生物學功能與信號通路的富集分析 將蒼耳子散活性成分靶點與SAR靶點取交集,并通過R語言繪制韋恩圖,得到共同靶點19個。應用可視化和富集分子功能(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)數據庫(https://david.ncifcrf.gov)進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,功能注釋聚類以及BioCarta和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路映射[7]。將19個靶基因輸入列表,標識選擇“official-Gene-symbol”進行分析,得到數據結果并進行可視化處理。

1.6 蒼耳子散活性成分-SAR靶點-信號通路網絡圖構建 運用CytoScape 3.7.2構建蒼耳子散活性成分-SAR靶點-信號通路網絡圖,利用CytoNCA分析活性成分及靶點的網絡拓撲參數,包括DC、CC、NC等進一步分析得到核心靶點及主要活性成分。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠60只,雄性,12周齡,體質量200～220 g,購自北京維通利華實驗動物科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006,飼養于北京中醫藥大學東方醫院實驗動物中心屏障動物飼養室。飼養環境:大鼠按照組別分籠飼養,房間內每隔12 h進行明暗交替,室內溫度保持在18～22 ℃,相對濕度40%～60%,自由飲水和進食。適應性飼養7 d。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號:JDF-IRB-2021031302)。

1.7.2 藥物 蒼耳子散顆粒劑組成:蒼耳子9 g、辛夷9 g、白芷15 g、薄荷3 g。購自北京康仁堂藥業有限公司并提供質量控制檢測,使用前采用沸水溶開至濃度1 g/mL,以便后續灌胃使用。

1.7.3 試劑與儀器 IgE酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(上海撫生實業有限公司,貨號:A098542);白細胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號:RF2481);γ干擾素(Interferon-Gamma,IFN-γ)ELISA試劑盒(上海聯祖生物科技有限公司,貨號:LZ-E030771);前列腺素內過氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase,PTGS)2 ELISA試劑盒(上海滬震生物科技有限公司,貨號:HZ-1014);PTGS1 ELISA試劑盒(上海優科唯生物科技有限公司,貨號:YKW-11129);蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)1 ELISA試劑盒(博爾森科技有限公司,貨號:YKW-11129);氫氧化鋁(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:C10115726)。低溫離心機(安徽科大中佳,型號:LC-4016);酶標儀(賽默飛世爾科技公司,型號:Thermo Scientific);恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司,型號:SYG-6);電子天平(常州奧豪斯儀器有限公司,型號:AX324ZH)。

1.7.4 方法

1.7.4.1 分組與模型制備 分組:正常對照組、模型對照組及蒼耳子散組,每組20只。模型制備:按文獻[8]造模方法制備變應性鼻炎AR大鼠模型,共40只。基礎致敏階段:以150 mg卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)作為抗原,15 g氫氧化鋁粉末作為佐劑,混懸于50 mL 0.9%氯化鈉溶液中,作為致敏劑。采用腹腔注射法,每只大鼠1 mL,隔日1次,共進行7次基礎致敏,用時14 d。正常對照組大鼠腹腔注射等容積的生理鹽水。局部刺激階段:第15～21天,采用滴鼻法,以2% OVA生理鹽水溶液滴入大鼠兩側鼻孔,每側50 μL,1次/d,正常對照組大鼠以等容積的生理鹽水進行滴鼻。大鼠鼻部行為學癥狀總評分大于5分為變應性鼻炎模型制備成功。

1.7.4.2 給藥方法 蒼耳子散組給予蒼耳子散顆粒3 mg/kg灌胃,模型對照組和正常對照組大鼠灌胃給予等容積的生理鹽水。2次/d,共灌胃14 d。

1.7.4.3 檢測指標與方法 末次給藥1 h后,用10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血5～10 mL,在離心管中靜置2 h后,于3 000 r/min離心機中離心10 min,離心半徑為10.06 cm,收集血清,于-20 ℃冰箱中儲存備用。檢測前取出,室溫環境下放置1 h后按照ELISA試劑盒說明書要求進行處理,檢測大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA含量。

2 結果

2.1 蒼耳子散組方活性成分初步篩選 共提取蒼耳子化學成分111個、辛夷化學成分184個、白芷化學成分223個、薄荷化學成分164個,對ADME特征篩選后共獲得蒼耳子活性成分11個、辛夷活性成分19個、白芷活性成分22個、薄荷活性成分10個。見表1。蒼耳子作用靶點42個、辛夷作用靶點31個、白芷作用靶點40個、薄荷作用靶點68個,合并后刪除重復值共得到靶點108個。

表1 蒼耳子散活性成分

2.2 蒼耳子散治療相關靶點預測與活性成分-靶點網絡構建 利用網絡圖形化工具Cytoscape 3.7.2對上述生物活性成分及預測的作用靶點進行關系網絡繪制和分析,得出節點共159個,邊共473條。通過網絡拓撲分析確定蒼耳子散發揮作用的生物活性成分主要為尼迪林(Cnidilin)、異二氫呋喃醌a(Isodihydrofutoquinol a)、加爾格雷芬(Galgravin)、木犀草素(luteolin)、腺苷醇c(Denudanolide c)、谷甾醇(Sitosterol)等,主要作用靶點為PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PTGS1、SCN5A、PIK3CG、DPP4、RXRA、CHRM1、AR、KCNH2、ESR1、GABRA1、β2-腎上腺素受體(Beta2-adrenergic Receptor,ADRB2)、PGR等。見圖1。

2.3 SAR相關靶點篩選 從GeneCards數據庫獲得SAR靶點628個。根據經驗設定Relevance大于中位數3.73的目標靶點為SAR的潛在靶點,最終得到320個SAR相關關鍵基因。

2.4 構建蒼耳子散治療SAR的PPI網絡及獲取核心靶點 對藥物靶點進行PPI網絡構建得到5 055個節點,126 097條邊,對疾病靶點進行PPI網絡構建得到6 183個節點,142 213條邊。將結果應用merge工具進行融合構建PPI網絡,得到3 536個節點、97 200條邊的融合網絡(Merge Network)。通過網絡拓撲分析插件CytoNCA分析得到結果,設定Degree值>2倍中位數,篩選得到核心網絡。通過設定網絡中DC、BC、CC、LAC及NC>中位數的節點得到核心作用靶點。見圖2。核心靶點輸入STRING 11.0數據庫中再進行PPI網絡構建,分析其參與的生物過程并進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能描述。見表2。

表2 蒼耳子散-SAR靶點PPI網絡功能描述

2.5 相關靶點生物學功能與信號通路的富集分析 首先將蒼耳子散活性成分靶點與SAR靶點取交集,得到共同靶點19個。見圖3。應用DAVID數據庫進行基因注釋富集分析,功能注釋聚類以及BioCarta&KEGG通路映射。結果可見多個靶點的功能與炎癥介質及氧化應激有關。其中蒼耳子散治療SAR主要參與的生物過程包括基因表達的負調控(Negative Regulation of Gene Expression)、對缺氧的反應(Response to Hypoxia)、內皮細胞增殖的正調控(Positive Regulation of Endothelial Cell Proliferation)、

圖3 蒼耳子散成分-SAR靶點韋恩圖

胞外信號調節激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,Erk)1和Erk2級聯的負調控(Negative Regulation of Erk1 and Erk2 Cascade)、腫瘤壞死因子產生的負調控(Negative Regulation of Tumor Necrosis Factor Production)、前列腺素的生物合成過程(Prosta-glandin Biosynthetic Process)、炎癥反應(Inflammatory Response)等。相關靶點調節Sar的功能主要富集于血紅素結合(Heme Binding)、前列腺素-內過氧化物合酶活性(Ptgs Activity)、雙加氧酶活性(Dioxygenase Activity)、一氧化氮合酶調節劑的活性(Nitric-oxide Synthase Regulator Activity)、過氧化物酶活性(Peroxidase Activity)等。

參與的信號通路包括鈣信號通路、缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號通路、Toll樣受體信號通路、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)信號通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信號通路、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信號通路、叉頭盒O(Forkhead Box O,FoxO)信號通路等。見表3,圖4～5。

圖4 蒼耳子散治療SAR靶點的GO分析

圖5 蒼耳子散治療SAR靶點的KEEG分析

表3 蒼耳子散治療SAR靶點通路富集結果

2.6 蒼耳子散活性成分-SAR靶點-信號通路網絡圖構建 運用CytoScape 3.7.2構建蒼耳子散活性成分-SAR靶點-關鍵信號通路網絡圖。見圖6。應用CytoScape 3.7.2內置的Network Analyzer插件分析網絡拓撲學參數,得到核心的活性成分及核心作用靶點。結果提示前5位活性成分如下:柚皮苷、谷甾醇、木犀草素、阿沙西汀及蘆薈大黃素,活性成分相關的DC、BC及CC。見表4。

圖6 蒼耳子散成分-靶點-通路網絡

表4 蒼耳子散主要活性成分網絡節點特征參數

PTGS2在網絡中的DC為44,BC為0.615 271 67,CC為0.609 022 56,預測PTGS2為蒼耳子散治療變應性鼻炎SAR最主要靶點。PIK3CG、PTGS1、AKT1、TNF、ADRB2、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、IL1β亦為相對重要的靶點。見表5。

表5 蒼耳子主要活性成分靶點網絡節點特征參數

2.7 蒼耳子散對大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA表達量的影響 模型對照組大鼠血清中IL-4、IgE、PTGS2、PTGS1、AKT1的含量明顯高于正常對照組,差異有統計學意義(P<0.01),蒼耳子散組大鼠血清中IL-4、IgE、PTGS2、PTGS1、AKT1水平均明顯低于模型對照組,差異有統計學意義(P<0.01);與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清中IFN-γ含量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01),蒼耳子散組大鼠血清中IFN-γ較模型對照組升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ、PTGS2、PTGS1、AKT1 mRNA的表達比較

3 討論

SAR屬于中醫學“鼻鼽”范疇,是臨床常見病,如治療不及時可出現鼻息肉及哮喘等疾病。中藥復方在預防及治療季節性發作方面有獨特優勢,尤其在改善鼻塞、流涕等癥狀方面擁有極大潛力。孫珊等[9]通過干祖望脫敏湯合蒼耳子散治療AR臨床觀察中發現純中醫組、純西醫組、中西醫結合組均為治療AR有效方法,中西醫結合組遠期療效更優,證屬風邪所致者均可本方加減治療。牛銀花和侯紅枝[10]通過玉屏風合蒼耳子散治療持續性肺氣虛型AR發現,玉屏風和蒼耳子散能夠調節患者體內Th1/Th2細胞因子失衡狀態,緩解患者鼻黏膜炎癥反應,從而改善患者癥狀表現。王龍妹等[11]發現,蒼耳子水煎液對細胞免疫作用明顯。另外,在AR豚鼠模型研究中發現,蒼耳子水提取物可以改善AR豚鼠的過敏性癥狀,同時減輕AR豚鼠鼻黏膜的病理改變,降低血清中IL-4水平,升高IFN-γ的水平,從而調節Th1/Th2細胞因子平衡,降低血清IgE水平,發揮療效[12]。

在臨床研究中發現肺氣失宣為鼻鼽主要病機,《諸病源候論·鼻病諸侯》載:“肺氣通于鼻,其臟有冷,冷隨氣入乘于鼻,故使津涕不能自收。”故中醫認為鼻鼽多因體虛衛表不固,風寒乘虛而入,上犯鼻竅,肺氣失宣,津液內停,鼻竅壅塞,遂致鼻塞、噴嚏、流清涕[13]。另有研究認為本病多分為以下4個證型:肺氣虛寒,衛表不固;脾氣虛弱,清陽不升;腎陽不足,溫煦失職;肺經伏熱,上犯鼻竅[14]。其中以肺氣虛寒為常見證型,治療原則以溫肺散寒、疏風通竅為主。蒼耳子散出自《嚴氏濟生方》,為治療鼻科疾病的經典方劑,文中所述:“辛夷仁半兩,蒼耳子兩錢半,香白芷一兩,薄荷葉半錢,上曬干,為細末,每服兩錢,食后用蔥、茶清調下。”現代則多以湯劑蔥茶調服。方中蒼耳子、辛夷發散風寒,通鼻竅,蒼耳子兼祛風濕;白芷祛風、燥濕、消腫、止痛。薄荷性味辛涼,疏散風熱,清利頭目,防止辛溫藥助陽太過。組方主治肺氣虛寒證的鼻鼽患者,亦可配伍健脾益腎,或清熱涼血藥治療其他證型的患者,發揮其疏風通竅的功效。

本研究應用網絡藥理學的方法對蒼耳子散治療SAR的關鍵活性成分進行分析,提示主要活性成分為柚皮苷、谷甾醇、木犀草素等。AR相關實驗基礎研究表明,柚皮苷腹腔注射能顯著抑制OVA致敏模型小鼠的氣道高反應性和氣道重塑,抑制支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)中IL-4、IL-13水平升高及核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的活化[15]。谷甾醇是一種天然植物,具有抗炎活性,能夠顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和環氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等炎癥介質的表達,并下調抗炎細胞因子(IL-10)的表達。同時抑制p-IκB-α激活和p38促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase,MAPK)的表達[16]。在細胞實驗研究中發現木犀草素通過MAPK和NF-κB信號通路抑制IL-33刺激的肥大細胞中IL-31的產生,抑制炎癥反應相關通路MAPK和NF-κB的活化[17]。

本研究結果表明,蒼耳子散治療SAR的靶點主要集中在PTGS2,而PIK3CG、PTGS1、AKT1、TNF、ADRB2、EGFR、IL1β亦為重要的調節靶點。PTGS是生物活性脂類調節物包括前列腺素、血栓烷和前列環素等各家族的前體。PTGS1和PTGS2都是膜整合蛋白。人PTGS2基因則被定位于1q25.2～25.3,約為8.3 kb大小,包含10個外顯子和9個內含子,且外顯子10顯著大于外顯子1～9,包含410 bp編碼區和全長為2 550 bp的3′非翻譯區。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的形成高度依賴于這些細胞中PTGS2的表達。TNF-α通過TNF通路能夠誘導PTGS2的產生,其作用機制為TNF-α增加了PTGS2基因的轉錄。另一方面,IL-4抑制PTGS2 mRNA和蛋白質的表達,以及類前列腺素的產生[18]。通過對藥物和疾病融合后的關鍵網絡進行GO功能富集分析顯示,蒼耳子散能夠通過調控mRNA代謝過程、調控基因表達、核酸代謝過程、含核堿基的化合物代謝過程對SAR發揮作用。在對相關通路富集分析研究中發現蒼耳子散調治SAR中,重要的通路包括鈣信號通、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、AMPK信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、FoxO信號通路等。HIF-1α直接介導iNOS和VEGF的轉錄,從而誘導血管通透性和炎癥反應,抑制HIF-1α改善了氣道中的過敏表型[19-20]。此外,HIF-1α抑制后,氣道高反應性顯著降低[21]。Toll樣受體信號通路與AR的研究亦發現,引起AR的Toll樣受體TLR(Toll-like Receptor,TLR)主要為TLR2、TLR4及TLR9,NF-κB是TLRs下游信號轉導通路,NF-κB以p50和p65組成的二聚體形式發揮作用,激活核內相關轉錄過程,使炎癥反應細胞因子表達增多,促進大量炎癥反應,同時誘導Th2表達細胞因子,導致Th1及Th2細胞因子失衡發生AR。另外,我們通過VOA大鼠AR模型進行靶點驗證,研究發現蒼耳子散可調節AR相關介質IgE、IL-4、IFN-γ的表達,且蒼耳子散治療后PTGS2、PTGS1、AKT1藥物靶點的mRNA表達較模型對照組均有顯著差異。

研究結果表明蒼耳子散中各活性成分可對不同靶點進行調控,而各個關鍵靶點又可介導不同的生物過程與信號通路,其與中醫藥治療疾病多靶點、多途徑的作用特點不謀而合。在應用網絡藥理學分析中,我們初步探究了蒼耳子散治療SAR的調節網絡,為臨床運用提供了一定依據。本研究的不足之處在于應通過實驗進一步驗證相關指標和靶點,為療效評價提供指標,盡早服務于臨床。

利益沖突聲明:無。