急性慢性高尿酸血癥大鼠模型的建立

張 馨 崔 娜 侯俊玲,3 王文全

(1 北京中醫藥大學中藥學院,北京,100102; 2 廊坊愛德堡醫院,廊坊,065000; 3 中藥材規范化生產教育部工程研究中心,北京,100102; 4 中國醫學科學院/北京協和醫學院/藥用植物研究所,北京,100193)

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝異常,產物產生過多和(或)排泄障礙所導致的一種代謝性疾病[1]。高尿酸血癥一詞在中醫文獻中沒有明確記載,有學者認為其屬“濕毒”范疇[2],從臨床看,歸屬中醫學“歷節”“痛風”等范疇。

近年來,隨著我國經濟高速發展,我國居民的生活習慣和飲食結構已發生重大改變,高糖、高脂和高嘌呤食物攝入量顯著上升。我國高尿酸血癥患病率呈逐年上升、發病年齡低齡化等趨勢。高尿酸血癥已成為繼高血脂、高血糖、高血壓之后的第4大健康風險因素,即常說的“第四高”[3]。

研究表明,高尿酸血癥不僅會引起痛風,也與心血管疾病、糖尿病、高血壓和慢性腎臟病關系密切[4-11]。由此可見,高尿酸血癥已是當前影響人類健康的一種嚴重疾病。近年來,中西醫在治療高尿酸血癥已獲得一定的成果和進展,尤其中醫憑借其獨特的優勢,成為治療高尿酸血癥的熱點。因此建立穩定的高尿酸血癥動物模型,對預防高尿酸血癥、篩選相關中西醫治療藥物尤為重要。

目前主要通過增加嘌呤攝入、抑制尿酸排泄和基因改造等方式進行造模[12-14]。由于至今仍沒有國內外統一規定和承認的造模方式,所以造模方式多種多樣,評價標準也各不相同。我們通過研究4種制造急性、慢性高尿酸血癥動物模型[15-16],進行多次眼眶取血,動態觀察大鼠血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標,評價各種模型的優缺點,以期為高尿酸血癥模型的合理建立和應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠72只,體質量180～220 g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,實驗動物許可證證號:SYXK(京)2017-0020,動物實驗倫理許可號:SLXD(京)-20210604021。大鼠飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級實驗動物中心,飼養溫度為(24±2)℃,相對濕度(60±10)%,采用12 h/14 h晝夜交替照明,動物自由進食和飲水。

1.1.2 藥物 氧嗪酸鉀(Oteracil Potassium,OAPS)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12677304);酵母膏(Yeast Extract,YE)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12434523);腺嘌呤(Adenine Phosphate,AP)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12642922);次黃嘌呤(Hypoxanthine,HX)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:H811076);鹽酸乙胺丁醇片(Ethambutol,EMB)(杭州民生藥業有限公司,批號:T21C068)。

1.1.3 試劑與儀器 羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl Cellulose Sodium,CMC-Na)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12286568);無水乙醇(北京化工廠,批號:201909412);10%中性甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,20210817);生理鹽水(山東華魯制藥有限公司,批號:H19010913);二甲苯(北京化工廠,批號:20190113);中性樹膠(上海儀器廠,批號:201901208);蘇木精染液(珠海貝索生物技術公司,批號:718072);伊紅染液(珠海貝索生物技術公司,批號:718091);血尿酸、血肌酐和尿素氮測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:C012-2-1;C011-2-1;C013-2-1)。全波長掃描酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司,型號:Multiskan Mk3];恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司,型號:HW·SY11-K);分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,型號:AL204];倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本,型號:IX73P1F);冷凍離心機(Eppendorf,德國,型號:Centrifuge 5430R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)急性高尿酸血癥大鼠模型:36只SD大鼠適應性飼養7 d,按體質量分為對照組、OAPS組和HX+OAPS組,每組12只。OAPS組給予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同時給予皮下注射生理鹽水。HX+OAPS組給予腹腔注射300 mg/kg OAPS,同時給予皮下注射500 mg/kg HX。對照組同法給予腹腔和皮下注射生理鹽水。大鼠腹腔注射劑量10 mL/kg,皮下注射劑量2.5 mL/kg。2)慢性高尿酸血癥大鼠模型:36只SD大鼠適應性飼養7 d,按體質量分為對照組、YE+AP+OAPS組和EMB+OAPS組,每組12只,對照組每天給予灌胃5% CMC-Na溶液;YE+AP+OAPS組每天給予灌胃15 g/kg YE的5% CMC-Na溶液,2 h后灌胃100 mg/kg AP的5% CMC-Na溶液,同時在第1、3、7、11、14天給予腹腔注射300 mg/kg OAPS生理鹽水溶液。EMB+OAPS組每天給予灌胃750 mg/kg OAPS和250 mg/kg EMB的5% CMC-Na混合溶液。以上各組普通飼料飼喂,正常飲水,連續飼喂2周,灌胃計量15 mL/kg,腹腔注射計量10 mL/kg。

1.2.2 檢測指標與方法 1)急性高尿酸血癥大鼠模型:分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、10 h目內眥采血0.5 mL,將血樣4 ℃靜置30 min,離心15 min(3 500 r/min,有效離心半徑10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置。檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮活性。2)慢性高尿酸血癥大鼠模型:在第14天,每組取6只大鼠腎臟進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色切片;在第28天,取剩余大鼠腎臟進行HE染色切片。在第4、6、8、11、14、15、16、18、20、22、25、28天大鼠目內眥采集血液1.5 mL,血樣4 ℃靜置30 min,離心15 min(3 500 r/min,有效離心半徑10 cm)取血清,-80 ℃冰箱放置,檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮水平。

2 結果

2.1 急性高尿酸血癥大鼠模型

2.1.1 各組血尿酸比較 與對照組比較,OAPS組和HX+OAPS組血尿酸在造模1 h左右均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)。在1～4 h間2組模型尿酸值均處于高水平,差異有統計學意義(P<0.01)。4～8 h尿酸值明顯下降,OAPS組在8 h左右,尿酸已經恢復正常水平,HX+OAPS組在10 h與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組急性高尿酸血癥大鼠血尿酸比較

2.1.2 各組血肌酐比較 與對照組比較,OAPS組在造模1～2 h之間血肌酐顯著升高(P<0.01),4 h后恢復正常水平。HX+OAPS組在4～10 h顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組急性高尿酸血癥大鼠血肌酐比較

2.1.3 各組尿素氮比較 與對照組比較,OAPS組在造模2 h尿素氮出現短暫升高情況,差異有統計學意義(P<0.05),之后恢復正常。HX+OAPS在1～10 h尿素氮均顯著高于正常水平,差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組急性高尿酸血癥大鼠尿素氮比較

2.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

2.2.1 各組血尿酸比較 與對照組比較,YE+AP+OAPS組血尿酸在4～20 d明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01),EMB+OAPS組在4～22 d明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組慢性高尿酸血癥大鼠血尿酸比較

2.2.2 各組血肌酐 與對照組比較,YE+AP+OAPS組血肌酐在4～6 d升高,差異有統計學意義(P<0.01),而EMB+OAPS組在14～16 d升高,差異有統計學意義(P<0.01),且在20 d和25 d也有短暫性升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

表5 各組慢性高尿酸血癥大鼠血肌酐比較

2.2.3 各組尿素氮比較 與對照組比較,YE+AP+OAPS組尿素氮在4～16 d顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01),EMB+OAPS組在11～28 d顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組慢性高尿酸血癥大鼠尿素氮比較

2.2.4 各組慢性高尿酸血癥大鼠組織病理學結果 在14 d切片中,與對照組比較,YE+AP+OAPS、EMB+OAPS組的腎臟損傷嚴重。損傷主要在腎小管,腎小管擴張嚴重,腎小管大面積管形,腎小管體積粗大,上皮變薄,空腔面積數倍增大并且空腔,在腎小管周圍存在炎癥細胞浸潤,腎組織纖維化。28 d切片中可以看出,YE+AP+OAPS組腎臟損傷有所恢復,表現在炎癥細胞和空腔結構的減少上,而EMB+OAPS組腎臟損傷并未有明顯改變。見圖1。

圖1 大鼠腎臟組織病理結果(HE染色,×100)

3 討論

尿酸是人嘌呤代謝的最終產物,主要通過肝臟、腎臟和腸道循環排出體外。高尿酸血癥多發生在靈長類動物中,是因為編碼尿酸氧化酶的基因失活,無法將尿酸進一步轉化成尿囊素從而導致尿酸在人體內的增加。高尿酸血癥的發生主要有2種途徑,生成過多和排泄障礙。基礎研究證實,90%的高尿酸血癥均由尿酸排泄減少所致,排泄障礙主要是指腎小管對尿酸的重吸收出現障礙,導致血尿酸水平異常升高,臨床上表現為肌酐和尿素氮的升高。中醫認為高尿酸血癥病位在于脾腎,其病因為七情內傷、外感六淫、飲食不節等[16],亦提示“腎”與高尿酸血癥有密切關系。因此認為,腎損傷可能是高尿酸血癥發生的重要原因。

隨著高尿酸血癥日益受到重視,找到一個穩定性好、重復性好的高尿酸血癥動物模型成為各項研究的重點,然而目前高尿酸血癥動物模型的誘導方法仍然存在周期長、穩定性差等問題。急性高尿酸血癥發作是當人體在一次性攝入過多高嘌呤物質,而體內未能及時將其代謝,會出現血尿酸的急性升高及輕微的腎損傷[17-18]。所以造模時也是采用讓動物體內尿酸一次性劇烈升高的方式。但是急性模型方法為單次造模,可觀察預防性給藥的療效,無法觀察治療性用藥的療效。目前常用的方法是一次性腹腔注射OAPS[19],方式單一,而且存在重復性不好的問題。本研究針對大鼠,通過將HX與OAPS聯合造模,與單一采用OAPS造模進行對比,以期篩選出有效穩定的急性模型。結果顯示,2種方法在造模后都顯著提高了尿酸水平,但是OAPS組高尿酸水平維持時間較短,而HX+OAPS組10 h時仍然維持在高水平。OAPS組出現了血肌酐和尿素氮短暫性升高,而HX+OAPS組同樣顯示出了更長時間的高水平。以上可以看出HX+OAPS組相比OAPS組高尿酸血癥癥狀維持時間長,作為急性預防模型有著更加明顯和穩定的高尿酸水平升高和腎臟損傷,更加適用于中西醫預防性藥物的篩選。

對于慢性高尿酸血癥模型造模機制，主要在于尿酸的長期積累從而導致其他疾病發生，尤其是腎臟疾病[20-22]。綜合之前學者的研究，選取了YE+AP+OAPS和EMB+OAPS這2種方式，造模給藥14 d后繼續觀察14 d，觀察模型維持情況[23-24]。結果顯示，2種模型均顯著提高了尿酸水平，停止給造模劑后可以維持1周左右時間，EMB+OAPS組維持時間更長。血肌酐和尿素氮結合病理切片結果顯示2種造模方式均出現腎臟損傷，YE+AP+OAPS組在停止造模后腎損傷情況有所改善，而EMB+OAPS組腎臟損傷更加嚴重，在停止給造模藥物2周后各項指標仍處于高水平。綜上所述，2種14 d的造模方式都可以顯著提高尿酸水平并伴有明顯的腎臟損傷，而且在停止造模后1周仍維持原來的高尿酸血癥病理狀態。說明14 d的造模方法可取，可以縮短造模時間但是沒有影響造模效果，一定程度上可以節約時間和成本費用。EMB+OAPS組比YE+AP+OAPS組高尿酸血癥病理狀態更明顯維持的時間更長在治療高尿酸血癥藥物篩選上EMB+OAPS造模方法更優于YE+AP+OAPS造模方法。

綜上所述,實驗中的造模方法操作簡單且實用性強,為中西醫治療高尿酸血癥藥物的開發提供了評價工具及基礎的造模數據。

利益沖突聲明:無。