隔藥餅灸調控子宮內膜異位癥小鼠磷脂酰肌醇3激酶信號通路的研究

辛 卉 周平生 徐 鵬 周志剛

(1 江西中醫藥大學研究生院,南昌,330004; 2 江西中醫藥大學國際教育學院,南昌,330004; 3 江西中醫藥大學中醫學院,南昌,330004)

子宮內膜異位癥(Endometriosis,EMT)是婦科常見病,疼痛是其最常見的臨床癥狀,并伴有其他癥狀,如盆腔包塊、性交痛和不孕等,對女性日常生活有嚴重影響[1]。目前EMT的發病機制尚不明確,但大部分學者認為黏附、侵襲、血管生成是EMT的基本病理過程。中醫認為EMT病機多為瘀血阻滯于胞宮,沖任失調所致[2]。有研究證明艾灸結合藥物治療對于EMT患者治療效果優于單純針刺患者[3]。研究表明EMT的形成與多條信號通路相關,其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)信號通路在EMT發生發展過程中發揮了重要作用[4]。本研究旨在通過觀察隔藥餅灸關元穴對于子宮內膜異位導致的痛經小鼠子宮PI3K、AKT、mTOR表達的影響,闡明隔藥餅灸對于PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響與隔藥餅灸治療EMT的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性重度聯合免疫缺陷病(Server Combined Immune Deficiency,SCID)小鼠42只,6～8周齡,體質量15～20 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004,符合動物實驗標準,在江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供的無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級實驗室內飼養。飼養條件:每籠5只,12 h光照/黑暗,室溫(24±2)℃,相對濕度45%～60%,排風壓差>10 Pa,滅菌飼料自由進食進水。本研究通過江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號:JZLLSC20210077)。

1.1.2 藥物 藥餅(將附子、肉桂、紅花、丹參、木香、當歸按照質量10∶2∶3∶4∶2∶3的比例制成藥粉,以黃酒調和做成直徑約1 cm,厚度約0.5 cm大小的藥餅);艾絨(江西鄱艾科技有限公司,批號:20190411);縮宮素注射液(上海上藥第一生化藥業有限公司,批號:200519);戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司,批號:450A);達那唑膠囊(江蘇聯環藥業股份有限公司,批號:03020181201)。

1.1.3 試劑與儀器 BCA蛋白定量試劑盒(批號:20201026)、ECL超敏發光試劑盒(批號:20201125)、電泳液(批號:20201027)、轉膜液(批號:20201027)、彩色預染蛋白質分子量標準(批號:20201129)、辣根過氧化物酶標記抗兔/抗小鼠二抗(批號:20201129),以上試劑均購自上海威奧生物科技有限公司。小型垂直電泳槽(型號:165-8001)、迷你濕轉印槽(型號:170-3930)、基礎電源(型號:164-5050),以上儀器均購自美國Bio-Rad伯樂公司;組織勻漿器(北京鼎昊源公司,型號:TL-2010S);全波長酶標儀(Thermo,美國,型號:MutiskanTM GO)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將42只小鼠適應性飼養7 d后,根據隨機區組分組法將小鼠分為正常組(n=8)和造模組(n=34)。除正常組外,造模組均參照造模方法建立子宮內膜異位小鼠模型[5],手術前2 d給予補佳樂0.5 mg/kg灌胃,使小鼠處于統一動情期(陰道涂片為大量無核角化細胞)。采用3%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,縱向切開腹壁,暴露左側子宮,并結扎子宮兩端,取中間一段子宮;縱向剖開取出的子宮,將子宮內膜及肌層分離成大小為5 mm×5 mm的片段,用7-0無菌眼科線將子宮內膜面固定于腹腔內壁上,并在腹腔內適量撒入頭孢氨芐膠囊粉末,最后逐層關腹、消毒。7 d后隨機挑選2只造模的小鼠,頸椎脫臼法處死觀察病灶處內膜形態和體積,當病灶部位出現直徑5～8 mm的半透明囊腫,內有液體積聚,并且有血管形成,則提示造模成功。隨后按照隨機區組分組法分為4組:模型組、西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組,每組8只。

1.2.2 給藥方法 1)造模結束后第28天起,隔藥餅灸組小鼠在關元穴進行隔藥餅灸,1次/d,每只灸4壯/次,持續時間約15 min,連續14 d。2)造模結束后第28天起,艾灸加西藥組先給予達那唑混懸液(以36 mg/kg給藥)灌胃,而后再在關元穴隔藥餅灸,1次/d,每只4壯/次,連續14 d。3)造模結束后第28天起,西藥組每天給予達那唑混懸液(以36 mg/kg給藥)灌胃,連續14 d。4)造模結束后第28天起,正常組和模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃,連續14 d。

1.2.3 取材 末次治療24 h后,在無菌條件下開腹,暴露腹腔后找到并分離出異位子宮內膜組織,使用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS)緩沖液清洗后,存于-80 ℃冰箱用于后續蛋白質印跡法(Western Blotting)實驗檢測。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 小鼠扭體反應 自治療第8天起,每次治療結束1 h后,通過對小鼠注射2個單位縮宮素后觀察并記錄30 min內小鼠扭體反應的次數。小鼠扭體反應的標準為:小鼠軀干伸展,腹部雙側向內凹同時收縮,一側后肢與臀部發生內旋[6]。

1.2.4.2 小鼠子宮異位組織(囊泡)體積及其抑制率 造模4周后,在無菌條件下開腹,用游標卡測量并記錄異位內膜(囊泡)的體積長(mm)×寬(mm)×高(mm);末次治療24 h后,麻醉小鼠后逐層開腹,觀察異位子宮組織(囊泡)形態及大小并測量其長、寬、高(mm),計算其體積及抑制率[7]:異位內膜組織(囊泡)生長抑制率=(治療前異位內膜組織體積-治療后異位內膜組織體積)/治療前異位內膜組織體積×100%。

1.2.4.3 蛋白質印跡法檢測 用酶抑制劑三聯裝提取小鼠子宮內膜異位組織總蛋白,用蛋白質定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit,BCA kit)法測出其總蛋白濃度。采用蛋白質印跡法,經電泳、轉膜、封閉后加入PI3K、AKT、mTOR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)一抗孵育(1∶1 000)過夜后,再洗膜后繼續二抗孵育(1∶2 000)2 h,再進行洗膜、曝光顯影、定影,分析蛋白表達水平。

2 結果

2.1 各組小鼠扭體反應結果 與正常組比較,模型組、西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應次數增多,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應次數低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);與西藥組比較,隔藥餅組、艾灸加西藥組小鼠扭體反應次數減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠扭體反應結果次,n=8)

2.2 各組小鼠生長抑制率和異位組織體積比較 西藥、隔藥餅灸、艾灸加西藥均可以縮小囊泡生長體積,隔藥餅灸組與艾灸加西藥組小鼠囊泡生長抑制率低于西藥組小鼠;與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠治療后異位子宮組織體積均減小(均P<0.05);與西藥組比較,隔藥餅灸組和艾灸加西藥組小鼠治療后異位子宮組織體積均減小(P<0.05);隔藥餅灸組小鼠與艾灸加西藥組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2,圖1。

圖1 各組小鼠囊泡大小比較

表2 各組小鼠生長抑制率和異位子宮組織體積比較

2.3 各組小鼠子宮PI3K/AKT/mTOR表達比較 與正常組比較,模型組小鼠異位內膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達增高,差異均有統計學意義(均P<0.05);與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組、艾灸加西藥組小鼠異位內膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達均下降,差異均有統計學意義(均P<0.05);與西藥組比較,艾灸加西藥組、隔藥餅灸組小鼠異位內膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達均下降,差異均有統計學意義(均P<0.05);與隔藥餅灸組比較,艾灸加西藥組小鼠異位內膜組織中的PI3K、AKT、mTOR表達均下降(均P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 各組小鼠異位子宮PI3K/AKT/mTOR電泳條帶

表3 各組小鼠子宮PI3K/AKT/mTOR表達比較

3 討論

EMT是婦科常見病,其主要表現為進行性持續加重的經期腹痛、慢性盆腔痛、不孕癥等。研究表明,周期性痛經可使女性產生焦慮、抑郁等負面情緒,影響患者身心健康,給患者日常生活及工作帶來困擾[8-10]。

根據EMT病因及臨床表現,在中醫學中可將其歸屬于“痛經”“月經不調”等范疇[11]。隔藥餅灸作為隔物灸中較為常見的一種類型,具有鮮明的中醫治療優勢[12-13],一方面能發揮灸的作用,另一方面通過皮膚組織對藥物的進一步吸收從而發揮其藥理效應,充分發揮了艾灸與藥物和穴位之間多重相互作用。雖然目前灸法的作用機制尚不明確,有研究表明隔藥餅灸可抑制EMT血管的異常增生[14],并且可以影響EMT裸鼠異位內膜組織微RNA(miRNA)的表達,揭示了隔藥餅灸的作用機制[15-16]。研究發現針灸治療EMT主要取穴為關元、三陰交等,以任脈、足太陰脾經為主[17]。前期文獻研究發現針灸治療EMT的療效優于中、西藥組;在痛經視覺模擬評分法評分方面,針灸效果更佳[18]。《醫宗金鑒·刺灸心法要訣》中有:“關元補虛瀉濁遺?！标P元穴是任脈上重要的穴位,具有培腎固本、補氣回陽的功效,也是臨床治療痛經的常用穴之一。楊東霞等[19]、李茜[20]的研究發現近年來通過艾灸關元穴等治療EMT療效優于其他治療方法,并且散結止痛、活血化瘀效果明顯。在隔藥餅灸中,藥餅的主要成分有附子、肉桂、紅花、丹參、木香等。其中附子、肉桂善于補火助陽、回陽救逆、散寒止痛、溫通經脈,紅花、丹參善于活血通經、散瘀止痛,木香可以行氣止痛等。雖然目前尚不能明確隔藥餅灸的作用機制,但在藥餅灸及穴位刺激的共同作用下,EMT模型小鼠扭體次數顯著低于模型組,證明在關元穴上進行隔藥餅灸治療能夠有效緩解EMT小鼠疼痛癥狀,具有良好的鎮痛效果。

EMT的發病機制目前尚不明確,但有研究表明相關信號通路的異常激活以及多細胞因子的共同作用都會影響異位內膜的黏附、侵襲,血管生成及凋亡[14,21-22]。PI3K/AKT/mTOR是EMT發病中的一條關鍵信號通路[23],廣泛存在于細胞中,具有調節細胞的生長、增殖、凋亡的作用。在EMT中,當炎癥介質刺激細胞后,活化細胞內的PI3K且磷酸化蛋白活化AKT[24];被激活后的PI3K-AKT通過磷酸化進一步將活化mTOR,mTOR受p-AKT調控,作為其下游靶蛋白,活化后的mTOR能促進細胞的生長、增殖及凋亡[25]。LIU等[26]研究發現抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可以緩解EMT模型大鼠坐骨神經痛癥狀。梁莉等[27]研究發現EMT痛經大鼠異位內膜組織PI3K-AKT信號通路相關基因蛋白PI3K、AKT水平與異位內膜生長正相關。

通過測定各組小鼠異位內膜組織中的PI3K、AKT及mTOR表達水平,以及異位內膜組織體積觀察比較,本研究認為EMT的異位內膜生長與組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白高表達相關,而隔藥餅灸組的PI3K、AKT及mTOR蛋白水平降低更為顯著,推測在關元穴上進行隔藥餅灸應該能夠有效抑制EMs模型小鼠異位內膜組織中PI3K、AKT及mTOR的表達,從而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活,緩解小鼠痛經癥狀,對EMT起到正向的治療作用。

綜上所述,從行為學角度,通過小鼠扭體反減少,觀察到隔藥餅灸對于EMT的痛經癥狀具有良好的鎮痛作用。從形態學角度觀測到囊泡體積的減小及生長抑制率的降低證明隔藥餅灸對于EMT小鼠異位病灶的生成具有抑制作用。從分子水平角度,在進行隔藥餅灸治療后,PI3K、AKT表達水平降低,進而抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路、抑制PI3K及AKT進一步磷酸化,弱化mTOR的激活,從分子層面證明隔藥餅灸對于EMT模型小鼠是有效的。因此,我們推測在關元穴實施隔藥餅灸,可以減輕疼痛烈度并抑制囊泡生長,其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路中關鍵蛋白PI3K、AKT及mTOR的表達有關。

利益沖突聲明:無。