急性缺血性腦卒中患者血清CKLF1、claudin-5預測溶栓后出血轉化的價值及與短期預后的關系

劉源,劉星,禹紅,熊武忠,王樂

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是臨床最常見的卒中類型,據中國腦卒中防治報告,2019年我國腦卒中發病率為201/10萬,死亡219萬人,其中AIS發病率為145/10萬,死亡103萬人,AIS已成為我國居民死亡的主要原因之一[1]。靜脈溶栓是在時間窗內恢復AIS血流灌注的最有效手段,能快速恢復缺血半暗帶血流灌注改善缺損神經功能[2]。出血轉化(hemorrhagic transformation,HT)作為靜脈溶栓后最常見、最嚴重的并發癥,嚴重影響AIS患者預后[3]。目前尚無預測靜脈溶栓后HT可靠的方法或手段,研究表明, 炎性反應等機制引起的血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞是HT發生的重要原因之一[4-5]。趨化素樣因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1)是一種C-C趨化因子,能通過結合C-C基序趨化因子受體(C-C motif chemokine receptor,CCR)4/5觸發一系列炎性細胞因子釋放,促進炎性反應發生發展[6]。claudin-5是一種跨膜蛋白,對維持BBB緊密連接至關重要,其結構和分布異常與BBB破壞密切相關[7]。目前,關于血清CKLF1、claudin-5與AIS患者靜脈溶栓后HT的關系尚不清楚,現分析AIS患者血清CKLF1、claudin-5預測靜脈溶栓后HT的價值及與短期預后的關系, 報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年7月—2021年1月武漢市中醫醫院神經內科收治接受靜脈溶栓的AIS患者321例為AIS組,男203例,女118例;年齡42～76(58.86±9.94)歲;體質量指數19.74～28.45(23.60±1.71)kg/m2。另選取醫院同期體檢健康志愿者60例為健康對照組,男38例,女22例;年齡36～80(57.85±8.31)歲;體質量指數19.95～26.89(23.35±1.59)kg/m2;2組性別、年齡、體質指數資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經武漢市中醫醫院醫學倫理委員會批準(20190179),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①AIS符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]中相關診斷標準,且為初次發病;②發病至入院時間<4.5 h,具備靜脈溶栓適應證[9],并完成常規劑量靜脈溶栓;③年齡≥18歲;④入院時完成實驗室檢查及顱腦CT檢查。(2)排除標準:①腦出血或既往腦出血病史;②近3個月內腦外傷或既往腦部手術史;③靜脈溶栓禁忌證(正在服用口服抗凝藥、國際標準化比值>1.7等)[9];④血管內介入治療(動脈溶栓、機械取栓、橋接治療等);⑤AIS前已合并中樞神經系統疾病;⑥血液、免疫系統損害,惡性腫瘤,嚴重心、肝、腎、肺功能損害;⑦臨床資料不全;⑧多次溶栓;⑨院內死亡、不能接受隨訪。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清CKLF1、claudin-5水平檢測:AIS患者入院翌日晨和健康對照組體檢時采集空腹肘靜脈血5 ml,離心留取上層血清。采用酶聯免疫吸附法檢測血清CKLF1(試劑盒為深圳海思安生物技術有限公司,貨號HAS-51562)、claudin-5(試劑盒為武漢伊艾博科技股份有限公司, 貨號E11713h)水平。

1.3.2 HT判定和分組:AIS患者靜脈溶栓后48 h內或癥狀變化時再次行頭顱CT/MR檢查,參考《中國急性腦梗死后出血轉化診治共識2019》[10]:腦梗死后首次頭顱CT/MR未發現出血,而再次頭顱CT/MR檢查時發現有顱內出血,或根據首次頭顱CT/MRI可以確定的出血性梗死判定為HT。根據是否發生HT將AIS患者分為HT亞組和非HT亞組。

1.3.3 預后判定和分組:AIS患者靜脈溶栓出院后通過電話或門診復查隨訪3個月,隨訪截止于2021年4月,通過改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRS)評估預后,總分值0～6分,≥3分表示預后不良[11]。根據mRS評分將AIS患者分為預后不良亞組和預后良好亞組。

2 結 果

2.1 AIS組與健康對照組血清CKLF1、claudin-5水平比較 AIS組血清CKLF1、claudin-5水平高于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與AIS組血清CKLF1、claudin-5水平比較 [M(Q1,Q3),ng/L]Tab.1 Comparison of serum CKLF1 and claudin-5 levels between healthy control group and AIS group

2.2 AIS患者靜脈溶栓后HT發生在不同臨床病理特征中差異分析 321例AIS患者靜脈溶栓后發生HT 63例(19.63%)。與非HT亞組比較,HT亞組患者年齡較大,心房顫動、心源性栓塞比率高,NIHSS評分高,CKLF1、claudin-5水平高(P均<0.01),見表2。

表2 AIS患者靜脈溶栓后HT發生的因素分析Tab.2 Analysis of factors affecting the occurrence of HT in AIS patients after intravenous thrombolysis

2.3 AIS患者靜脈溶栓后HT的多因素Logistic回歸分析 以AIS患者靜脈溶栓后是否出現HT為因變量,以上述結果中P<0.05項目為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,心源性栓塞、NIHSS評分升高和血清CKLF1、claudin-5水平升高為AIS患者靜脈溶栓后HT的獨立危險因素(P<0.01),見表3。

表3 AIS患者靜脈溶栓后HT的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of HT after intravenous thrombolysis in AIS patients

2.4 不同預后AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平比較 AIS患者321例靜脈溶栓后3個月mRS評分≥3分88例,預后不良發生率為27.41%(88/321)。預后不良亞組血清CKLF1、claudin-5水平高于預后良好亞組(P<0.01),見表4。

表4 不同預后AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平比較 [M(Q1,Q3),ng/L]Tab.4 Comparison of serum CKLF1 and claudin-5 levels in AIS patients with different prognosis

2.5 AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平與mRS評分的相關性 Spearman相關性分析顯示,AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平與mRS評分呈正相關(rs=0.517、0.491,P均<0.001)。

2.6 血清CKLF1、claudin-5水平對AIS患者靜脈溶栓后HT的預測價值 繪制血清CKLF1、claudin-5水平對AIS患者靜脈溶栓后HT的預測價值ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清CKLF1、claudin-5水平單獨及二者聯合預測AIS患者靜脈溶栓后HT的AUC分別為0.769、0.772、0.876,二者聯合預測的AUC大于CKLF1、claudin-5單獨預測(Z/P=2.542/0.011,3.786/<0.001),見表5、圖1。

圖1 血清CKLF1、claudin-5水平預測AIS患者靜脈溶栓后HT的ROC曲線Fig.1 Serum CKLF1 and claudin-5 levels predict the ROC curve of HT in AIS patients after intravenous thrombolysis

表5 血清CKLF1、claudin-5水平對AIS患者靜脈溶栓后HT的預測價值Tab.5 Predictive value of serum CKLF1 and claudin-5 levels for HT after intravenous thrombolysis in AIS patients

3 討 論

HT是指AIS后缺血區域血管在恢復血流灌注后導致的出血,靜脈溶栓雖然能通過溶解血管內堵塞血栓,使阻塞血管重新獲得血流灌注,但溶栓藥物的抗血栓作用還能引起纖維蛋白原降解和破壞BBB,導致HT發生[12]。HT可導致靜脈溶栓后神經功能改善的AIS患者神經功能再次惡化，是AIS患者預后不良的危險因素之一[13]。本研究中,321例AIS患者靜脈溶栓后HT發生率為19.63%,這與姜文娟等[14]報道的21.38%接近,說明AIS患者靜脈溶栓后HT發生率較高。因此,早期識別HT發生對改善AIS患者預后具有重要意義。

BBB破壞被認為是HT關鍵的機制,AIS后神經細胞缺血死亡能釋放“危險信號”激活腦內固有免疫反應,促進活性氧、炎性細胞因子、趨化因子等神經毒性物質產生,引起神經炎性級聯反應,破壞BBB導致HT發生[15-16]。趨化因子是一類在機體血管新生、細胞增殖、炎性反應、免疫調節等多種病理生理過程中發揮重要作用的分子蛋白[17]。CKLF1是新近發現的一種主要表達于單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等免疫細胞的趨化因子,具備C-C趨化因子的結構和特征,能通過C端結合CCR4/5,不僅能趨化免疫細胞遷移至炎性反應部位,還能激活核因子-κB、細胞外調節蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3等一系列轉錄因子,在炎性反應中發揮重要作用[18]。研究報道[19],抑制CKLF1與CCR4結合能抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3活化,進而減少局灶性缺血性腦損傷后炎性反應。敲低CKLF1能抑制CKLF1/CCR5介導的中性粒細胞遷移,減輕腦缺血大鼠腦內炎性反應[20]。同時Zhou等[21]研究報道,下調CKLF1能抑制核因子-κB激活,進而抑制大鼠腦卒中后小膠質細胞M1型極化。上述研究表明,CKLF1與腦卒中神經炎性反應密切相關,而神經炎性反應與BBB破壞密切相關,因此筆者推測CKLF1可能參與HT發生。本研究結果顯示,AIS患者血清CKLF1水平升高,且是靜脈溶栓后HT發生的獨立危險因素,說明血清CKLF1水平升高會增加AIS患者靜脈溶栓后HT風險。分析原因可能是CKLF1升高能結合其受體CCR4/5趨化免疫細胞至炎性反應部位,并激活多條炎性反應信號通路,導致神經炎性反應并破壞BBB[22],進而增加HT風險。實驗也顯示[23],抑制CKLF1能通過抑制炎性反應減少BBB基底膜降解,維持BBB完整性和通透性,進而改善大鼠腦缺血BBB功能。于大君等[22]臨床研究也報道,外周血CKLF1升高與高血壓腦出血患者BBB破壞有關。

BBB由一層緊密排列的無孔內皮細胞單層形成,這些細胞通過緊密連接蛋白復合物機械連接在一起,嚴格限制了循環血液和大腦微環境之間的分子交換,細胞緊密連接蛋白缺失將導致BBB滲透性損害,導致HT發生[24]。claudin是構成內皮細胞緊密連接的主要蛋白,其中claudin-5是BBB中最富集的緊密連接蛋白,其表達濃度直接決定了BBB緊密連接部分的滲透性[25]。肖志博等[26]研究報道,上調缺血區域claudin-5表達能保護腦缺血再灌注后BBB完整性。Gholamzadeh等[27]研究報道,上調腦組織claudin-5表達能改善大腦中動脈閉塞大鼠BBB完整性。上述研究表明,claudin-5對保護腦卒中后BBB完整性至關重要,然而關于claudin-5與AIS患者靜脈溶栓后HT的關系尚未可知。本研究結果顯示,AIS患者血清claudin-5水平升高,是靜脈溶栓后HT發生的獨立危險因素,說明血清claudin-5水平升高會增加AIS患者靜脈溶栓后HT風險,這與上述研究報道claudin-5具有BBB保護作用結果不相符。分析原因可能是血清claudin-5水平升高由BBB被破壞滲漏所致,故血清claudin-5水平越高反映BBB破壞越嚴重,導致更多的claudin-5自BBB滲漏至血液循環中[28]。

本研究結果還顯示,心源性栓塞和NIHSS評分增加也是AIS患者靜脈溶栓后HT的獨立危險因素,分析原因可能是心源性栓塞反映患者心臟結構和功能存在損害,心臟輸出量降低影響腦血管功能,增加HT風險;NIHSS評分越高反映患者病情越危重,BBB破壞可能更嚴重,因此HT風險更高[29-30]。本研究通過分析血清CKLF1、claudin-5水平與短期預后的關系發現,預后不良亞組血清CKLF1、claudin-5水平明顯升高,且AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平與mRS評分呈正相關,這說明血清CKLF1、claudin-5水平升高與AIS患者靜脈溶栓后短期預后密切相關。分析原因可能是血清CKLF1、claudin-5水平升高會加劇AIS患者BBB破壞,導致神經功能持續惡化,進而影響預后[31-32]。本研究ROC曲線顯示,血清CKLF1水平為40.01 ng/L時,預測AIS患者靜脈溶栓后HT的AUC為0.769;血清claudin-5水平為93.33 ng/L時,預測AIS患者靜脈溶栓后HT的AUC為0.772;血清CKLF1聯合claudin-5預測AIS患者靜脈溶栓后HT的AUC為0.876,較CKLF1、claudin-5單獨預測更大。說明靜脈溶栓前檢測血清CKLF1、claudin-5水平有助于預測AIS患者靜脈溶栓后HT發生,且二者聯合能提升預測價值。

綜上所述,AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平升高,與靜脈溶栓后HT發生和短期預后不良密切相關,血清CKLF1、claudin-5水平對AIS患者靜脈溶栓后HT具有一定預測價值,且二者聯合能提升預測價值。但本研究結果還需多中心大樣本研究證實。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉源:提出研究思路,設計研究方案,論文撰寫,論文修改;劉星:實施研究過程,文獻調研與整理;禹紅:分析試驗數據,論文終審;熊武忠、王樂:數據收集,統計學分析