不同品種大麥表皮微生物研究

李永強，任婷月*，韓 英，甄 攀

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司 技術中心，山西 汾陽 032205）

清香型白酒是中國白酒三大基本香型之一，獨特的工藝結合獨特的微生物菌群結構造就了清香型白酒清香純正的風格特征[1]。汾酒大曲是一種以生料大麥、豌豆為原料，自然接種環境中的微生物，經過微生物的生長代謝和能量代謝形成的微生物生態制品，具有糖化、發酵、增香的作用[2-4]。

大麥屬禾本科植物，富含碳水化合物、蛋白質等大分子物質，此外，含有鈣、磷等礦質元素，適合多種微生物生長，是清香型白酒的主要制曲原料[5-7]。不同品種的大麥由于其生長地區、氣候、儲藏條件的不同，其內生微生物、表皮微生物的差異，會對制曲造成一定的影響。近年來，已經有較多采用高通量測序技術解析植物表皮微生物群落結構的研究[8-9]。張二豪等[10]利用高通量測序技術對蘋果表皮及根際土壤微生物的群落結構與多樣性進行研究，并對優勢微生物菌屬進行關聯性分析；張世偉等[11]采用高通量測序技術研究了不同品種葡萄表面的微生物群落結構差異，表明不同品種是最關鍵的影響因素。何萍等[12]采用高通量測序技術對不同品種葡萄果實表皮微生物群落組成進行研究，結果表明，不同品種間微生物群落結構組成及相對豐度有較大的差異。目前，有關大麥表皮微生物多樣性的研究尚非常少，且有關不同大麥品種原料對于大曲發酵影響的相關研究也知之甚少。

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術對以上三個不同品種的大麥表皮細菌和真菌群落結構進行解析，分析不同品種大麥表皮細菌和真菌的多樣性，旨在為清香型白酒制曲原料大麥的質量把控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三個不同品種的大麥：DM1（甘啤6號，產地甘肅，清香型白酒現用大麥品種），DM2（汾麥30，產地山西）、DM3（大麥3018，產地山西）。DM2、DM3為本項目團隊優選大麥父本、母本，采用系譜法選育得到的新大麥品種，具有遲播早收、生育期短、抗逆性強、畝產高、容重高的優良種植特性，適宜山西南部臨汾市、運城市及黃淮冬麥區種植。

使用經體積分數75%的酒精消毒后的鑷子按照“五點取樣法”取大麥種子樣品，置于無菌自封袋中，-20 ℃冷凍備用。每個樣品取3個樣本作為平行樣。

MoBio PowerSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit（100）試劑盒：德國QIAGEN公司；2×TaqPlus Master Mix試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；AgencourtRAMPureRXP（核酸純化試劑盒）：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 儀器與設備

SORVALL RC6 Plus高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GelDoc-It凝膠成像系統：美國UVP公司；NanoDrop2000超微量分光光度計：美國賽默飛公司；Agilent 2100生物分析儀：安捷倫科技有限公司；Labchip GX生物大分子分析儀：珀金埃爾默儀器有限公司；ABI 9700基因擴增聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，ABI 7500實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitive PCR，RT-fqPCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq PE300高通量二代測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

在50 mL無菌離心管中加入10 g大麥樣品和30 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），旋渦振蕩，使大麥表皮的微生物富集于PBS中，直接提取緩沖液中的微生物。使用DNA Isolation Kit試劑盒提取基因組DNA，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進行檢測。

1.3.2 PCR擴增

以總基因組DNA為模版進行PCR擴增，細菌16S rRNA基因的V3-V4區相關引物對為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。真核ITS2區相關引物對為：ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

PCR擴增體系和擴增條件參照相關文獻方法[13]。PCR擴增產物委托北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進行測序。

1.3.3 高通量測序結果分析

利用QIIME1（v1.8.0）軟件對測序所得的原始序列進行去噪、拼接和質控后，使用UPARSE軟件（version 7.1）根據97%的相似度對優質序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并進行物種注釋。使用QIIME1（v1.8.0）軟件進行Alpha多樣指數分析。使用R（v3.6.0）軟件進行物種組成柱狀圖分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 樣品Venn圖分析

對9個大麥樣品表皮微生物細菌16S rRNA基因的V3-V4區以及真菌ITS2區進行PCR擴增和測序，對各樣本優化后共得到677 155條有效細菌序列和896 479條有效真菌序列，在97%相似度下劃分OTU。

Venn圖可直觀分析各個樣本的OTU數目和各樣本間的重疊情況[14-15]。由圖1a可知，9個大麥表皮樣本共915個細菌OTUs，DM1、DM2、DM3樣品所產生的OTU數分別為566個、668個、517個；共有細菌OTU數為279個，特有細菌OTU數分別為119個、152個、87個。由圖1b可知，9個大麥表皮樣本共產生了397個真菌OTUs，DM1、DM2、DM3樣品所產生的OTU數分別為334個、228個、199個；共有真菌OTU數為131個，特有真菌OTU數分別為125個、19個、20個。以上結果表明，不同品種大麥表皮微生物群落結構組成差異較大。

圖1 不同品種大麥樣品基于細菌（a）、真菌（b）操作分類單元的Venn圖Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic unit of different varieties of barley samples based on bacteria (a) and fungi (b)

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線可反映樣品的測序深度，可用來說明測序的數據量是否合理。由圖2可知，細菌與真菌的測序深度合理，能反映樣本中微生物的實際情況。

圖2 不同品種大麥樣品細菌（a）、真菌（b）稀釋性曲線Fig.2 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) of different varieties of barley samples

2.3 Alpha多樣性分析

Chao1指數表示菌種豐富度，Shannon指數用來表征菌種多樣性[16]。由圖3可知，DM1樣品的細菌和真菌豐富度和多樣性最高，DM3樣品的細菌和真菌豐富度和多樣性最低。

圖3 不同品種大麥樣品細菌（a、b）及真菌（c、d）Alpha多樣性箱圖Fig.3 Box diagram of bacterial (a,b) and fungal (c,d) alpha diversity of different varieties of barley samples

2.4 細菌群落多樣性分析

由圖4（a）可知，基于門水平，從三個大麥樣本中共得到5個優勢細菌門（平均相對含量＞1%），分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和藍細菌門（Cyanobacteria）。DM1樣品中的優勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍細菌門，平均相對含量分別是70.8%、12.5%、12.3%、2.6%、1.4%。DM2樣品中的優勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門，平均相對含量分別是82.5%、5.3%、8.6%、2.1%和1.0%。DM3樣品中的優勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門，平均相對含量分別是92.9%、2.3%和2.9%。以上結果表明，三個大麥表皮樣本菌群結構差異較大，且變形菌門在三個品種大麥樣本中均占絕對優勢。

圖4 基于門（a）和屬（b）水平不同品種大麥樣品細菌群落結構Fig.4 Bacterial community structure of different varieties of barley samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖4（b）可知，基于屬水平，DM1的表皮細菌多樣性顯著高于DM2和DM3。DM1樣品共有7個優勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、泛菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類芽孢菌屬（Paenibacillus）、Pedobacter、薄層菌屬（Hymenobacter），平均相對豐度分別為20.8%、17.8%、12.3%、11.7%、9.06%、5.05%、4.20%。DM2、DM3樣品中均有2個優勢菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是泛菌屬（Pantoea）和假單胞菌屬（Pseudomonas），其平均相對豐度為60.9%、62.3%和11%、26.3%。泛菌屬是一類廣泛存在于自然界且功能多樣的微生物[17]。假單孢菌屬普遍分布于植物中，對植物生長、生物防治和養分利用等方面具有有益作用[18-21]。研究發現，泛菌屬存在于多種植物的種子中，且多為優勢類[22]。在連續3代的蘿卜種子中，發現泛菌屬和假單胞菌屬也是主要類群[23]；LEVEAU J H J等[24]研究發現，霞多麗葡萄上的優勢菌屬為假單胞菌屬。RAHMAN M等[25]研究表明，Pantoea和Pseudomonas具有促進植物生長和抵抗真菌性病害等功能。綜上所述，DM2和DM3樣品中富含與植物生長和生物防治相關的微生物。

2.5 真菌群落多樣性分析

由圖5（a）可知，基于門水平，從三個大麥樣本中，共得到3個優勢真菌門（平均相對豐度＞1%），分別為擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。DM1樣品中的優勢真菌門為擔子菌門、子囊菌門和毛霉門，平均相對豐度分別是62.0%、27.1%、10.5%。DM2樣品中的優勢真菌門為擔子菌門和子囊菌門，平均相對豐度分別是85.9%、13.8%。DM3樣品中的優勢真菌門為子囊菌門和擔子菌門，平均相對豐度分別是80.7%、18.9%。以上結果表明，大麥表皮樣本中，主要存在擔子菌門、子囊菌門這兩類，三個大麥樣本菌群結構差異較大。

圖5 基于門（a）和屬（b）水平不同品種大麥樣品真菌群落結構Fig.5 Fungal community structure of different varieties of barley samples based on phylum (a) and genus (b) levels

由圖5（b）可知，基于屬水平，DM1的表皮真菌多樣性顯著高于DM2和DM3。DM1樣品中共有9個能準確鑒定的優勢菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是類型孢子菌屬（Tylospora）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Dioszegia、鏈格孢屬（Alternaria）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）和鎖霉屬（Itersonilia），其平均相對豐度分別是18.2%、10.4%、9.3%、8.8%、8.2%、6.5%、6.2%、6.2%和4.0%。DM2樣品中共有6個優勢細菌屬（平均相對豐度＞1%），分別是擔子菌門一類未鑒定的屬、類型孢子菌屬（Tylospora）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和擲孢酵母屬（Sporobolomyces），平均相對豐度分別是71.7%、5.2%、5.2%、4.8%、4.1%和3.6%。DM3樣品中共有5個優勢細菌屬（平均相對豐度＞1%）分別是復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、類型孢子菌屬（Tylospora）、畢赤酵母屬（Pichia）和鏈格孢屬（Alternaria），平均相對豐度分別是67.8%、7.3%、5.8%、3.6%和2.6%。三個大麥品種優勢菌屬差異較大，可能與產地、氣候和品種等因素有關。復膜孢酵母屬是清香型白酒大曲上霉的主要微生物，可分泌淀粉酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶類，降解大分子底物，為釀酒酵母等其他白酒發酵微生物的生長提供營養[26]。DM3樣品中復膜孢酵母屬為絕對優勢真菌屬。鏈格孢屬是一類世界范圍廣泛分布的真菌，存在于自然界的不同基質上，可作為腐生菌、寄生菌和內生菌，是重要植物病原菌，可造成多種作物的嚴重病害[27]。DM3樣品中鏈格孢屬相對豐度最低。

2.6 基于細菌、真菌OTU水平的不同品種大麥樣品主成分分析

主成分分析（PCA）可直觀地將樣品間、樣品組間差異程度體現在二維坐標圖上，樣品間距離越近表示其物種組成越相似。

由圖6a可知，第一主成分PC1方差貢獻率為61.09%，第二主成分PC2方差貢獻率為12.9%。DM3中兩個樣本與DM2距離較近，DM1與DM2、DM3距離較遠，表明三個大麥品種細菌群落結構差異較大。由圖6b可知，第一主成分PC1方差貢獻率為49.92%，第二主成分PC2方差貢獻率為34.23%。三個大麥品種組分布距離較遠，表明三個大麥品種真菌群落結構差異較大。

圖6 基于細菌（a）、真菌（b）操作分類單元水平的不同品種大麥樣品主成分分析Fig.6 Principal component analysis of different varieties of barley samples based on operational taxonomic unit level of bacteria (a) and fungi (b)

3 結論

采用Illumina Miseq高通量測序技術對不同大麥品種表皮微生物群落結構研究發現，甘啤6號的細菌和真菌豐富度和多樣性均最高，大麥3018的細菌和真菌豐富度和多樣性均最低。甘啤6號與汾麥30、大麥3018細菌群落結構差異較大，三個大麥品種真菌群落結構差異較大，甘啤6號產地為甘肅，汾麥30、大麥3018產地為山西，由此表明大麥的生長環境對大麥表皮細菌群落結構的影響較大，大麥品種對其表皮真菌群落結構的影響較大。從細菌群落結構分析來看，甘啤6號表皮樣本的優勢細菌屬相對豐度較高的依次是假單胞菌屬（Pseudomonas）、馬賽菌屬（Massilia）、泛菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類芽孢菌屬（Paenibacillus）等。汾麥30、大麥3018樣本中，相對豐度較高的依次是泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。從真菌群落結構分析來看，甘啤6號中相對豐度較高的依次是類型孢子菌屬（Tylospora）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、維希尼克氏酵母菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Dioszegia等。汾麥30樣本中擔子菌門一類未鑒定的屬為優勢菌屬；大麥3018樣本中復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）為優勢菌屬。本研究揭示了不同品種大麥表皮微生物群落結構的差異，為清香型白酒制曲原料大麥的選擇和質量把控提供了理論依據，并為進一步完善制曲大麥質量評價指標提供了科學依據。