混菌發酵對‘123’蘋果酒香氣成分的影響

王燕榮，胡海霞，史曉霞，劉樂紅

（內蒙古農業大學 職業技術學院，內蒙古 包頭 014109）

‘123’蘋果，又名‘金紅’小蘋果，水分含量為85%，糖含量為10%～14.2%，蘋果酸含量為0.38%～0.60%，此外還有蛋白質、抗壞血酸、尼克酸、胡蘿卜素、硫胺素、鈣、磷、鐵等多種營養成分[1]。果酒由水果發酵而成，保留水果的營養，且酒精含量低，風味各異，成為時尚消費品。酵母菌是發酵果酒的主要微生物，是影響果酒口感和香氣的重要因素之一。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）酒精發酵能力強，但釀酒過程中原料具有的風土特色香氣物質難以被釋放，產品的特點不突出[2]。非釀酒酵母通過分泌酶降解糖苷鍵釋放芳香化合物，以及通過自身代謝直接合成或調整風味成分，使得果酒氣味芬芳，酒體典型性突出[3-6]。利用釀酒酵母與非釀酒酵母共同發酵來改善果酒風味成為研究熱點之一。曾朝珍等[7]研究表明，在異常漢遜酵母與釀酒酵母的協同作用下有效促進了蘋果白蘭地中酯類、醇類物質的合成，降低了脂肪酸的含量。祝霞等[8]研究發現，戴爾凱氏有孢圓酵母與釀酒酵母混菌發酵，可提高貴人香低醇甜葡萄酒中酯類、高級醇以及萜烯類香氣物質，賦予了酒樣強烈的花香、果香。申靜云等[9]利用不同有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發酵威代爾冰葡萄酒，促進了酯類和萜烯類物質的合成，總量分別增加88.61%和21.40%，顯著增強花果香和黃油味。LóPEZ S等[10]篩選出漢遜酵母應用于Muscat葡萄酒的增香釀造，并驗證了所產糖苷酶活力及其水解特性。陶永勝等[11]評價了野生膠紅酵母的糖苷酶對媚麗新酒中香氣糖苷的水解潛力。張曼等[12]使用美極梅奇酵母與商業釀酒酵母間隔48 h順序接種發酵脆李果酒，結果表明在香氣方面，辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇顯著提高。因此，釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵成為釀酒行業新的發展趨勢。篩選釀造‘123’蘋果酒適合非釀酒酵母，優化混菌發酵接種方案，對開發‘123’蘋果酒具有積極意義。

本研究利用優選的卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）兩株非釀酒酵母分別與一株商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發酵‘123’蘋果酒，以單菌種發酵為對照，分析不同酒樣理化指標、香氣成分以及感官香氣特征的差異性，確定‘123’蘋果酒混合發酵方案，以期為生產風味獨特的‘123’蘋果酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘123’蘋果：2021年9月23日取自內蒙古自治區包頭市土右旗，還原糖含量為142 g/L，總酸含量為6.37 g/L。

卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）：均由內蒙古特色果酒系列產品產學研科技創新平臺實驗室分離篩選并保存；商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DS：法國諾盟公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrosemedium，YPD）培養基（生化試劑）：青島海博生物技術有限公司；甲醇、2-辛醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、異丁醇、1-己醇、異戊醇、異戊酸、辛酸、癸酸、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛等香氣物質標準品（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

QP2020 SYSTEM氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司；BS-1E振蕩培養箱：上海高致精密儀器有限公司；SA2202S-CW電子天平：德國賽多利斯公司；2000JP果汁離心機：南通金橙機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母培養與計數

將保藏的非釀酒酵母在YPD固體培養基上劃線培養，28 ℃條件下培養48 h后重復活化一次。挑取菌落特征明顯的菌株接種于200 mL YPD液體培養基中，28 ℃、180 r/min條件下培養24 h，取培養液用無菌生理鹽水稀釋計數并配制成濃度為1×106CFU/mL的酵母種子液，將酵母種子液接種于果汁中進行發酵。釀酒酵母DS按照產品說明進行活化后用無菌生理鹽水稀釋計數配制酵母種子液。發酵過程中每48 h取樣，根據釀酒酵母和非釀酒酵母在WL培養基上的菌落形態進行分類計數。

1.3.2‘123’蘋果酒釀造工藝流程與操作要點

操作要點：

分選清洗：選擇成熟度較好，無腐爛發霉的‘123’蘋果，清洗控干水分。

榨汁、糖度調整：‘123’蘋果榨汁后添加白砂糖，調整糖度為200 g/L。

滅菌裝罐：將蘋果汁70 ℃滅菌15 min，分裝于用亞硫酸滅菌處理的20 L玻璃發酵罐中，每罐裝10 L蘋果汁。

接種酵母：將非釀酒酵母和釀酒酵母單菌種和混合培養（混菌接種比例為1∶1）按照總接種量為6%接種到10 L果汁中進行發酵。

酒精發酵：控制發酵溫度不超過30 ℃，當糖含量＜4 g/L或連續48 h不再變化時視為發酵結束。

倒罐陳釀：發酵結束后將上清酒液倒入空罐中，加入50 mg/L SO2，自然陳釀2個月，取樣用于后續分析。每個處理重復3次。

1.3.3 發酵組設計

對照組：設置三個對照組，分別為接種單一釀酒酵母（CK），單一葡萄汁有孢漢遜酵母（HU），單一卡利比克邁耶氏酵母（MC）。

混合發酵組：葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母同時接種發酵（HS1）；先接種葡萄汁有孢漢遜酵母，48 h后接種釀酒酵母（HS2）；先接種釀酒酵母，48 h后接種葡萄汁有孢漢遜酵母（HS3）。卡利比克邁耶氏酵母與釀酒酵母同時接種發酵（MS1）；先接種卡利比克邁耶氏酵母，48 h后接種釀酒酵母（MS2）；先接種釀酒酵母，48 h后接種卡利比克邁耶氏酵母（MS3）。

1.3.4 理化指標檢測

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，測定還原糖、總酸、揮發酸、酒精度[13]。

1.3.5 揮發性香氣成分測定

‘123’蘋果酒揮發性香氣成分檢測方法參考尹薦等[14]的方法，采用頂空固相微萃取（head space solid phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質譜聯用技術檢測。

樣品預處理：取8 mL酒樣，2.0 g NaCl，2-辛醇內標（400 μg/L）加入頂空瓶中，在40 ℃水浴中平衡15 min，在40 ℃條件下攪拌吸附萃取30 min，取出插入GC進樣口，230 ℃解吸5 min取出。

GC-MS分析條件：進樣口溫度230 ℃，載氣為高純氦氣（99.999%），流速1.5 mL/min，不分流進樣。色譜柱為DB-WAXETR（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃保持5 min，以2 ℃/min的升溫速度上升到130 ℃，再以5 ℃/min的速度上升到220 ℃，保持10 min。離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍35～350 amu，掃描頻率0.2 s/次。

定性定量分析：提取揮發性成分質譜圖，并根據標準品的保留時間，通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）17譜庫查詢，計算各揮發性成分的保留指數進行定性分析。采用內標法定量。

1.3.6 香氣評價

采用定量描述分析法對‘蘋果酒的香氣進行評價。感官品評小組有8位經過培訓的老師和學生組成（4男4女），并從Davis香氣輪盤中選取合適的詞匯進行香氣特征描述確定的感官描述（果香、花香、乙醇味、脂肪味、酸味），按照0～5分對特征香氣強烈程度進行評分，無香氣特征為0分，香氣特征非常弱為1分，香氣特征弱為2分，香氣特征中等為3分，香氣特征強為4分，香氣特征非常強為5分。

1.3.7 數據統計分析

運用SPSS 23.0對不同酵母發酵‘123’蘋果酒各理化指標和香氣物質進行單因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA）和多重比較分析（multiple com parisonanalysis，MCA），并對香氣物質進行主成分分析（principalcomponent analysis，PCA），應用Origin2018作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酵母菌生長變化分析

不同接種處理對蘋果酒發酵過程中酵母菌生長的影響見圖1。

圖1 ‘123’蘋果酒發酵過程中酵母菌生長變化情況Fig.1 Growth status of yeast during '123' cider fermentation

由圖1a可知，單菌發酵S.cerevisiae在第6天數量達到最大，為7.10×108CFU/mL，第16天發酵結束仍在106數量級。M.caribbica與H.uvarum單菌發酵均在第6天數量達到最大值，在第20天發酵終止，M.caribbica數量為1.43×103CFU/mL，H.uvarum數量為2.22×105CFU/mL。馮文倩等[15]的研究表明，H.uvarum在模擬葡萄汁中21 d完成酒精發酵，與本試驗有一致結果。可見，由于非釀酒酵母酒精發酵能力弱，延長了發酵時間，隨著營養物質的消耗，以及酒精度的增加，使非釀酒酵母在發酵后期數量下降明顯。

由圖1b、1c可知，混合發酵處理中，同時接種混合菌種時（HS1和MS1），在發酵第12天后和第10天后檢測不到H.uvarum與M.caribbica活菌；在HS2、HS3、MS2、MS3順序接種處理組中兩種非釀酒酵母可以貫穿整個發酵周期，且整個發酵過程中非釀酒酵母數量穩定在（106～107）數量級，但在發酵后期釀酒酵母數量要高于非釀酒酵母數量。尤雅等[16]研究也有相似結果。同時接種相同數量的釀酒酵母和非釀酒酵母，最能反映酵母之間的競爭能力，試驗結果表明H.uvarum與S.cerevisiae的競爭力優于M.caribbica。混合發酵中釀酒酵母的代謝產物乙醇、中鏈脂肪酸、殺傷毒素以及多肽，兩種酵母的細胞接觸，基質中的營養競爭等都是影響非釀酒酵母生長的因素[17-18]。

由上述結果可知，在‘123’蘋果酒釀造過程中，釀酒酵母與非釀酒酵母存在競爭，同時接種方案中非釀酒酵母生長受到明顯抑制，而順序接種中非釀酒酵母在整個發酵進程中能保持一定數量。

2.2 蘋果酒基本理化指標分析

發酵結束后‘123’蘋果酒基本理化指標見表1。由表1可知，S.cerevisiae參與發酵的處理組還原糖含量均低于4 g/L，酒精發酵完全，酒精度為9.28%vol～10.88%vol。H.uvarum與M.caribbica單菌種發酵的處理組酒精發酵緩慢，發酵結束后酒精度分別較CK低23%和28%，并且還原糖含量較高；混菌發酵處理組酒精度顯著低于CK組（P＜0.05），有研究表明大多數非釀酒酵母酒精發酵能力較低，H.uvarum約消耗19 g/L糖產生1%vol的酒精[19]。非釀酒酵母的氧化代謝消耗葡萄糖而不形成乙醇，通過其他代謝途徑轉換為甘油等化合物[20]。

表1 ‘123’蘋果酒的基本理化指標Table 1 Physiochemical indexes of '123' cider

總酸檢測結果表明，MC與MS2處理組總酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），可能與M.caribbica代謝產生酸類物質有關。本試驗所有處理組的揮發酸含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》規定（＜1.2 g/L）[21]，非釀酒酵母發酵酒樣揮發酸含量均高于對照組，其中HU組最高，較CK增加了36%，提前接種非釀酒酵母處理組HS2與MS2揮發酸含量也顯著高于CK。夏鴻川等[22]同樣發現提前接種H.uvarum會增加酒樣中揮發酸含量。

混菌發酵過程中，由釀酒酵母主導酒精發酵，同時接種和先接種釀酒酵母的發酵酒樣均獲得較高的酒精度；M.caribbica使果酒中總酸含量增加；兩種非釀酒酵母發酵增加了果酒中揮發酸含量。

2.3‘123’蘋果酒香氣成分分析

發酵結束的各酒樣中香氣成分測定結果見表2。由表2可知，共檢出揮發性香氣成分56種，包括品種香氣成分11種、發酵香氣成分45種，有高級醇11種、酯類化合物20種、脂肪酸類化合物7種、其他香氣化合物7種。其中，香氣化合物濃度與嗅覺閾值的比值，即香氣活力值（odor active value OAV）＞1的有10種，OAV為0.1～1.0的香氣化合物有11種。HS2酒樣中香氣物質總含量最高，為9 302.20 μg/L；單菌發酵處理組也有較高的香氣物質，HU酒樣香氣物質總含量（9 259.37 μg/L）顯著高于CK（P＜0.05），MC酒樣香氣物質總含量與CK沒有顯著差異（P＞0.05）；在混菌發酵中，先接種非釀酒酵母的酒樣中香氣物質總含量顯著高于同時接種和后接種非釀酒酵母的處理組（P＜0.05）。

表2 ‘123’蘋果酒香氣成分測定結果Table 2 Determination results of volatile aroma components of '123' cider

2.3.1 品種香氣成分分析

樣品中品種香氣成分包括1種C6化合物（正己醇）、2種萜烯醇（香茅醇、芳樟醇）、1種苯衍生物（苯乙醇）、2種揮發性酚（丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚）。9個酒樣中有6個酒樣（HU、HS1、HS2、HS3、MC、MS2）的品種香氣物質含量高于對照組，其中酒樣HS2最高為1 902.80 μg/L，較CK增加了63.4%，其次是HU為1 835.21 μg/L，表明H.uvarum發酵有利于品種香氣物質的生成。M.caribbica單菌種發酵酒樣中品種香氣成分表現較好，但混菌發酵酒樣中品種香氣成分不同程度有所降低，可能由于兩種菌互作影響品種香氣物質的代謝。

2.3.2 發酵香氣成分分析

樣品的發酵香氣中有高級醇3種，酯類11種，脂肪酸4種，其他化合物5種，其中正辛醇、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸、辛酸、己醛9種化合物的OAV＞1。

高級醇類物質是糖類或氨基酸代謝的副產物，含量＜300 mg/L時能襯托酯香，促進香氣的協調性和復雜性[23]。試驗酒樣的高級醇含量為1 501.06～2 169.48 μg/L，均＜300 mg/L，高級醇含量最高的為HU、CK、HS2，分別是2 169.48 μg/L、2 107.96 μg/L、1 851.28 μg/L，均顯著高于其他處理組（P＜0.05）。酒樣中含量最高的為異戊醇，含量為888.95～1 581.17 μg/L，異戊醇具有蘋果白蘭地香氣，是雜醇油的主要成分[24]，含量高會引起頭暈，本研究中混菌發酵酒樣中異戊醇含量均低于單菌種發酵酒樣。各酒樣中正辛醇的OAV＞1，賦予了酒樣柑橘和玫瑰的香氣。庚醇的OAV為0.1～1.0，增加了酒樣檸檬和橘子的香氣。

酯類化合物是酒精發酵的副產物之一，能賦予果酒花香和果香氣味[25]。酯類化合物中以乙酸酯和乙醇酯為主，酒樣HU中乙酸酯含量最高為1 533.07 μg/L，可能是由于H.uvarum酯酶活性較高。除MS3乙酸酯含量低于對照組，其余酒樣中乙酸酯含量均顯著高于對照組（P＜0.05），說明兩種非釀酒酵母在蘋果酒發酵中產乙酸酯的能力較強。乙酸異戊酯嗅覺閾值較低，且在所有酒樣中OAV＞1，能賦予果酒果香和鮮香蕉的氣味。酒樣中檢測到的乙醇酯中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯OAV＞1，其中辛酸乙酯具有最高的OAV（87.44～180.45），為果酒帶來草莓、菠蘿和梨的香氣。CK中乙醇酯含量顯著高于其他組（P＜0.05），這與LEE P等[26]研究結果類似，釀酒酵母菌株發酵能代謝較高的乙醇酯，而非釀酒菌株能生產較高的乙酸酯。

脂肪酸含量接近氣味閾值時，可賦予果酒奶酪、黃油等風味，使酒體香氣平衡[27]。MS2與HS2酒樣中脂肪酸含量分別為1 721.35 μg/L和1 533.75 μg/L，顯著高于其他組（P＜0.05），說明先接種非釀酒酵母混菌發酵有利于果酒脂肪酸含量的提高。所有處理酒樣中辛酸含量最高，且CK、HU、HS1、HS3、MC和MS3酒樣中辛酸OAV＞1，使果酒具有黃油的香氣。

在酒樣中還檢測到了3種醛類化合物、1種酚類化合物和1種烯類化合物，CK酒樣中這些物質總含量顯著高于其他組。每個酒樣中均檢測到了甲基胡椒酚、α-金合歡烯，其中甲基胡椒酚的含量最高，有大茴香的氣味，α-金合歡烯則有花香和脂香。

混菌發酵中，先接種非釀酒酵母有利于提高香氣物質總量及脂肪酸含量；H.uvarum發酵可增加蘋果酒中品種香氣含量；兩種非釀酒酵母均表現出有較強的乙酸酯生產能力，而釀酒酵母則是乙醇酯生產能力強。

2.3.3 特征香氣成分主成分分析

一般認為，OAV＞0.1的香氣物質與相似的香氣物質疊加能夠一定程度增加酒體的香氣及協調性，OAV＞1的香氣物質可能直接影響酒體香氣，被認為是特征香氣物質[28-29]。為進一步分析各處理酒樣之間揮發性香氣成分的差異，對不同處理酒樣及其OAV＞0.1的21種揮發性香氣物質進行主成分分析（PCA），結果見圖2。

圖2 ‘123’蘋果酒中特征香氣化合物主成分分析Fig.2 Principal component analysis for characteristic aroma compounds in '123' cider

由圖2可知，主成分PC1方差貢獻率占33.2%，PC2方差貢獻率占21.4%，前兩個主成分累計方差貢獻率為54.6%。9種酒樣在置信區間被很好地區分開，對照組CK與混菌發酵組均不在同一象限內，說明混菌發酵對‘123’蘋果酒風味有顯著影響。HU、MC和HS1在同一象限，且距離較近，與香氣物質乙酸己酯、月桂酸乙酯和辛酸乙酯相關較大；雖然MS2和HS2在同一象限，但距離較遠，HS2與香茅醇、丁香酚、乙酸乙酯和2,4-二叔丁基苯酚相關性較大；MS2與己醛、壬醛和乙酸苯乙酯相關性較大。MS1、MS3和HS3與乙酸異戊酯相關性較大。而與CK相關性較大的香氣物質是庚酸、辛酸和庚醇。

2.4 蘋果酒感官香氣分析

不同接種方式發酵的‘123’蘋果酒感官香氣評價雷達圖見圖3。由圖3可知，所有非釀酒酵母發酵的處理組乙醇味均低于CK，與理化指標檢測結果一致。CK的脂肪味也最強烈，與主成分分析中CK酒樣脂肪酸相關性較大的結果一致。各組酸味比較接近。如圖3a所示，果香、花香和酸味較突出的是H.uvarum單菌發酵的酒樣，其次是同時接種和先接種H.uvarum酒樣，后接種H.uvarum會明顯影響果酒的香氣。HU K等[30]的研究也表明，H.uvarum在混菌發酵中能夠增加葡萄酒的花香和水果香氣。如圖3b所示，M.caribbica單菌種發酵酒樣有較好的果香與花香，但與S.cerevisiae混菌發酵明顯降低了酒樣的花香與果香，可能與S.cerevisiae影響了M.caribbica的生長代謝有關。2種非釀酒酵母可以提高‘123’蘋果酒的感官香氣品質。

圖3 ‘123’蘋果酒感官香氣評價雷達圖Fig.3 Sensory evaluation radar map of '123' cider

3 結論

本實驗主要研究H.uvarum與M.caribbica分別與S.cerevisiae混合發酵對‘123’蘋果酒香氣成分的影響。總體來看，在發酵過程中，不同的順序接種對非釀酒酵母的生長有影響；混菌發酵降低了‘123’蘋果酒中乙醇含量，M.caribbica酵母使酒樣總酸含量增加，H.uvarum增加酒樣的揮發酸含量。非釀酒酵母有利于酒中品種香氣化合物和乙酸酯的生成，其中，先接種H.uvarum再接種S.cerevisiae組香氣物質總量最高，且顯著高于CK，并以2,4-二叔丁基苯酚、正辛醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等物質為特征香氣物質；先接種非釀酒酵母的混菌發酵酒樣中香氣物質總量顯著高于同時接種與后接種非釀酒酵母處理組。H.uvarum參與的混菌發酵的酒樣中品種香氣物質含量顯著高于CK，而CK則有較高的發酵香氣物質含量。M.caribbica單菌種發酵酒樣中香氣物質含量表現好于混菌發酵。

混菌發酵可以改變‘123’蘋果酒的香氣特征，先接種H.uvarum再接種S.cerevisiae（HS2）混菌發酵在完成酒精發酵的同時，最大程度的發揮了非釀酒酵母的產香特性，揮發性香氣物質總量最高，且品種香氣物質較CK增加了63.4%，果香和花香突出，此接種方案在‘123’蘋果酒增香釀造方面有應用潛力。后續將通過轉錄組及代謝組學深入研究H.uvarum與S.cerevisiae相互作用機理，進一步確定發酵調控參數，以期為‘123’蘋果酒釀造提供理論依據。