貴州南部紅酸湯理化指標與菌群結構的相關性分析

陸 敏，王雪雅，孫小靜，李文馨，殷 勇，陳 菊，蓬桂華*

（貴州省農業科學院 辣椒研究所，貴州 貴陽 550006）

紅酸湯作為我國三大特色火鍋底料之一，其制作是將紅辣椒、番茄發酵半年以上后磨漿，加入輔料（生姜、食鹽等）而成的一種發酵型辣椒制品，營養價值豐富，能夠幫助消化、調劑人體生理機能等[1]。黔南州、黔東南州作為貴州傳統的食酸地區，出現了以紅酸湯、白酸湯、蝦酸等為代表的一系列獨具貴州民族特色的發酵食品。2018年以來，貴州紅酸湯研究逐年遞增，主要研究集中在工藝的優化[2-5]、微生物多樣性的分析[6-11]、風味[12-14]及營養品質的解析利用[15-18]、優勢菌種的篩選[10，19-20]等方面。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術常用來深度挖掘發酵食品中的微生物群落組成，宮路路等[6-7]利用高通量測序技術篩選凱里紅酸湯和丹江鎮紅酸湯樣品中優勢微生物，結果表明，主要優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），主要優勢菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等。李娟[8]研究發現，紅酸湯中乳桿菌屬為絕對優勢細菌屬，畢赤酵母屬（Pichia）和酒香酵母屬（Brettanomyces）為優勢真菌屬。目前，關于紅酸湯理化指標和菌群多樣性之間相關性的研究報道較少。

本研究從貴州黔南州、黔東南州采集紅酸湯樣品，對其pH值、總酸、可溶性固形物含量等理化指標進行檢測，利用Illumina MiSeq高通量測序技術解析紅酸湯樣品的菌群多樣性，通過Spearman相關系數法研究優勢菌科與理化指標之間的相關性，以期對優質紅酸湯微生物資源進行開發利用，為發酵工藝優化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酸湯半成品：于2021年5月采集自貴州黔東南州酸湯企業樣品3份，編號為LT、JJ、TY；來自黔南州酸湯企業樣品3份，編號為ND、AD、YSQ。紅酸湯主要原料為辣椒和西紅柿，發酵8～9個月的未添加防腐劑發酵成熟的紅酸湯半成品充分混勻后，用無菌采樣袋密封保存至4 ℃冰柜備用。

TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；乙醇、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、鉻酸鉀、硝酸銀、甲醛（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Synergy HTX酶標儀：基因科技（上海）股份有限公司；HH-S24數顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；BSA224SC W電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PB-10 pH計：德國Sartorius公司；KQ-700DB型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；TD6離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；Veriti96well9902梯度基因擴增儀：美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序分析

DNA的提取：采用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，使用酶標儀對于提取的核酸濃度進行檢測。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：以提取的DNA為模板，細菌使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增，真菌使用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）在ITS1區進行PCR擴增。PCR擴增體系（10.0 μL）：0.3 μL上/下游引物引物（10 μmol/L）、5.0 μL KOD FX Neo Buffer、2.0脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2 mmol/L）、0.2 μL KOD FX Neo、DNA模板20 ng。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個循環；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。

高通量測序分析：純化擴增后的PCR產物，采用ImageJ v1.8.0軟件系統對回收產物進行檢測定量。使用e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit建庫，高通量測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。原始數據上傳至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）SRA數據庫。用Qsep-400方法對原始測序序列進行質控，使用Usearch v10軟件按照最小overlap長度為10 bp，overlap區允許的最小相似性90%、最大錯配堿基數5 bp（Default）對每個樣品的reads進行拼接。使用Usearch v10軟件對97%相似度的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行聚類分析并剔除嵌合體，得到優質序列。利用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier對每條序列進行物種分類注釋，并基于SILVA 138、UNITE 8.0、Greengenes 13.5、NCBI、fungene、MaarjAM數據庫對OTU進行分類學注釋。

1.3.2 理化指標的測定

總酸的測定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》；還原糖的測定：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》；pH值的測定：使用pH計；食鹽的測定：參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標準食鹽指標的測定》；氨基酸態氮的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》；可溶性固形物的測定：采用PAL-1糖度計。

1.3.3 數據處理與分析

采用Excel2019進行數據處理，SPSS Statistics26.0統計分析數據，Origin2018軟件用于繪制微生物群落組成圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）圖、層級聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）圖。

2 結果與分析

2.1 紅酸湯樣品理化指標檢測結果

pH值、總酸、可溶性固形物及氨基酸態氮含量是影響紅酸湯品質的重要因素，是紅酸湯自然發酵過程中重要的理化指標。紅酸湯樣品的理化指標檢測結果見表1。

表1 紅酸湯樣品的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of red sour soup samples

由表1可知，6個樣品的pH值為3.32～3.83，總酸含量為1.01%～2.59%，與張璇[21]對紅酸湯半成品檢測結果一致，但明顯低于舒亞非等[22]對二次加工的紅酸湯商品的檢測結果；可溶性固形物含量為10.40%～16.20%，可溶性固形物/總酸為4.94～14.73，其在樣品JJ的數值最高，樣品發酵時間相近（8～9個月），不同的可溶性固形物的含量可能是由于6個樣品的辣椒和西紅柿配比差異[21]；食鹽含量為2.691%～8.75%，樣品JJ含量最高，為8.75%；還原糖含量為1.11%～1.70%，氨基酸態氮含量為0.02%～0.11%，其可能與紅酸湯原料配比、食鹽等輔料配比及發酵過程中的微生物組成有關[4]。綜合DBS52/056—2021《食品安全地方標準酸湯》[23]和T/KLST 001—2021《凱里酸湯 紅酸湯》[24]，規定紅酸湯總酸≥1.5 g/100 g，氯化物（以Cl-計）≤5.0 g/100 g，氨基酸態氮（以氮計）≥0.12 g/100 g。樣品ND總酸、還原糖含量最高，分別為2.59%、1.70%，可溶性固形物含量、pH、氨基酸態氮含量較高，分別為12.80%、3.36、0.08%，食鹽含量最低，為2.97%，可溶性固形物/總酸最小，為4.94，品質較優。

2.2 紅酸湯樣品中微生物Alpha多樣性分析

稀釋性曲線用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。6個紅酸湯樣品中細菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線見圖1。

圖1 6個紅酸湯樣品中細菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in six red sour soup samples

由圖1A可知，樣品LT中細菌的稀釋曲線平緩，說明測序深度較好，測序數據量合理。其余5個紅酸湯樣品中細菌的稀釋曲線趨于平緩，其中樣品LT中細菌的豐富度最高，樣品JJ中細菌的豐富度則遠遠小于其他5個樣品，這可能是由于不同的紅酸湯制作工藝、原輔料選擇和發酵條件等因素的影響了發酵微生物菌群結構。由圖1B可知，6個紅酸湯樣品中真菌的稀釋曲線平緩，真菌的豐富度差異較小。

紅酸湯樣品細菌和真菌微生物群落Alpha多樣性分析結果見表2。

表2 6個紅酸湯樣品細菌和真菌菌群Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial and fungal communities in six red sour soup samples

ACE指數和Chao1指數都是用來反映物種數目的豐富度，Simpson指數和Shannon指數都是用來估算樣品中微生物的多樣性[11]。由表2可知，覆蓋率均≥99.85%，表明測序數據能夠覆蓋樣品中細菌及真菌的種類，可真實反映樣品中物種豐度及多樣性。6個紅酸湯樣品細菌的OTUs個數為116～513，ACE指數為251.04～707.63，Chao1指數為172.40～620.25，Simpson指數為0.23～0.99，Shannon指數為0.85～7.60。其中樣品JJ的OTUs個數、ACE指數、Chao1指數、Simpson和Shannon指數均遠遠小于其他5個樣品，物種豐富度及多樣性較差，樣品ND的OTUs個數、ACE指數、Chao1指數、Simpson和Shannon指數較高，其物種豐富度及多樣性較高。結合理化指標檢測結果，說明原輔料大分子物質的營養相互作用和內生環境因子（溫度、水分、酸度等）決定了傳統發酵食品微生物群落的構建及演替[25]，特別是高鹽、高酸度發酵環境會較大程度地抑制腐敗菌、病原菌及部分不耐鹽不耐酸細菌的生長。6個紅酸湯樣品真菌的OTUs個數、ACE指數、Chao1指數、Simpson和Shannon指數差異性較小，真菌的豐富度及多樣性差別不大。

2.3 基于門、科分類學地位的微生物群落結構分析

2.3.1 細菌菌群結構分析

基于門水平（A）和科水平（B）的紅酸湯樣品細菌菌群組成見圖2。

圖2 基于門（A）和科（B）水平的紅酸湯樣品細菌菌群結構Fig.2 Bacterial community structure of red sour soup samples at the phylum (A) and family (B) level

在門水平上，共檢測出22個細菌門，選取相對豐度前10的細菌門進行分析。由圖2A可知，除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品中的細菌門平均相對豐度依次為厚壁菌門（Firmicutes）（55.82%）、變形菌門（Proteobacteria）（13.29%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（12.16%）、放線菌門（Actinobacteria）（5.44%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（4.10%）、藍細菌門（Cyanobacteria）（3.08%）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（1.73%）、梭桿菌門（Fusobacteria）（1.18%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（0.95%）、Epsilonbacteraeota（0.63%），這與宮路路等[6-7，11]研究的西紅柿紅酸湯、辣椒紅酸湯中優勢菌落組成結構相似，樣品JJ和樣品AD與其余4個樣品在細菌門組成上差異性較大，這可能與其食鹽、酸度等理化指標的差異性有關。6個樣品中厚壁菌門的平均相對豐度均最高，其在樣品JJ中占絕對優勢，相對豐度達98.68%，其在樣品AD中占比最少，相對豐度為33.12%。變形菌門相對豐度為0.99%～16.55%，擬桿菌門相對豐度為0.02%～17.33%，放線菌門相對豐度為0.13%～7.65%。疣微菌門在樣品AD中相對豐度最高，為3.01%。酸桿菌門作為在土壤中最常見的嗜酸、寡營養、難培養的細菌門類之一[26]，在紅酸湯樣品中鮮有報道，其在樣品AD的相對豐度最高，為14.91%。厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門作為紅酸湯發酵后期的主要細菌門，也是人類腸道主要菌群[27]，兩者菌門結構組成的相似，與紅酸湯能夠改善腸道健康，促進食物的消化吸收有關。

在科水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出193個細菌科，選取相對豐度前10的細菌科進行分析。由圖2B可知，除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品中的細菌科平均相對豐度依次為乳桿菌科（Lactobacillaceae）（35.24%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）（6.43%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）（6.31%）、（Muribaculaceae）（5.59%）、普氏菌科（Prevotellaceae）（2.54%）、鏈球菌科（Streptococcaceae）（2.01%）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）（1.75%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（1.66%）和兩個未定名科uncultured_bacterium_o_Chloroplast（2.00%）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6（1.85%）。乳桿菌科的乳酸桿菌是發酵紅酸湯中的主要優勢細菌[8]，除樣品AD外，乳桿菌科相對豐度占比均最高，其在樣品JJ占絕對優勢，為98.52%。除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品的毛螺菌科相對豐度為4.30%～9.29%，瘤胃球菌科相對豐度為3.98%～8.96%，Muribaculaceae相對豐度為3.32%～7.08%，普氏菌科相對豐度為1.71%～4.32%，丹毒絲菌科相對豐度為1.01%～3.37%，這5個菌科的相對豐度在樣品ND中均最高，這可能與食鹽、酸度等發酵條件，溫度氣候等發酵環境的差異有關。

2.3.2 真菌菌群結構分析

基于門水平（A）和科水平（B）的紅酸湯樣品真菌菌群結構見圖3。

圖3 基于門（A）和科（B）水平紅酸湯樣品真菌菌群結構Fig.3 Fungal community structure of red sour soup samples at the phylum (A) and family (B) level

由圖3A可知，在門水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出10個真菌門，其真菌門平均相對豐度分別為子囊菌門（Ascomycota）（83.83%）、擔子菌門（Basidiomycota）（8.20%）、被孢霉門（Mortierellomycota）（3.30%）、壺菌門（Chytridiomycota）（1.64%）、油壺菌門（Olpidiomycota）（0.32%）、羅茲菌門（Rozellomycota）（0.27%）、球囊菌門（Glomeromycota（0.08%）、一個未分類真菌門Unclassified（2.34%）、梳霉門（Kickxellomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）平均相對豐度均＜0.05%。6個紅酸湯樣品真菌門結構組成相似，其中子囊菌門相對豐度為82.87%～85.74%，為優勢菌門。擔子菌門相對豐度為6.92%～9.00%、被孢霉門相對豐度為2.78%～3.69%、未分類菌門相對豐度為2.06%～2.66%、壺菌門相對豐度為1.43%～1.88%、油壺菌門相對豐度為0.27%～0.37%、羅茲菌門相對豐度為0.18%～0.36%、球囊菌門相對豐度為0.06%～0.13%，這與王琪琪等[11]研究的紅酸湯真菌門微生物區系組成相似。子囊菌門、擔子菌門等作為多種發酵食品中的主要真菌種群[28]，也在紅酸湯的發酵中發揮著重要的作用。

在科水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出132個真菌科，選取相對豐度前10的真菌科進行分析。由圖3B可知，叢赤殼科（Nectriaceae）（19.84%）、曲霉科（Aspergillaceae）（15.43%）、線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）（9.17%）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）（4.18%）、酵母科（Saccharomycodaceae）（3.92%）、被孢霉科（Mortierellaceae）（3.28%）、枝孢霉科（Cladosporiaceae）（2.61%）、假毛殼菌科（Trichosphaeriaceae）（1.81%）、生赤殼科（Bionectriaceae）（1.76%）、莢胞腔菌科（Sporormiaceae）（1.55%）在6個紅酸湯樣品中的平均相對豐度較高。叢赤殼科是紅酸湯發酵后期的優勢真菌科，在自然界以寄生或腐生的營養方式生存，其相對豐度為18.96%～20.65%。曲霉科在發酵類食品中較為常見，其相對豐度為14.10%～16.93%。線蟲草科相對豐度為8.86%～9.69%，毛殼菌科相對豐度為3.56%～4.56%，酵母科相對豐度為1.71%～8.98%。傳統紅酸湯的發酵過程是乳酸桿菌和酵母菌（Saccharomyces）的共同發酵[8]，酵母科的酵母菌其在產香、產酒等方面具有較強作用，能夠產生多種風味酯并貢獻乙醇和其他有機酸[29]。

2.4 紅酸湯樣品理化指標與菌群的相關性分析

選取理化指標（pH、食鹽、可溶性固形物/總酸、還原糖和氨基酸態氮）與相對豐度前10的細菌科及真菌科進行Pearson相關性分析，結果見圖4。

圖4 6個紅酸湯樣品中細菌科（A）、真菌科（B）與理化指標的相關性分析熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between bacterial families (A),fungal families (B) and physicochemical indexes in six red sour soup samples

由圖4A可知，乳桿菌科與pH呈顯著正相關（P＜0.05），鏈球菌科與pH呈高度顯著負相關（P＜0.001），Muribaculaceae與pH、可溶性固形物/總酸呈顯著負相關（P＜0.05），普氏菌科與可溶性固形物/總酸呈極顯著負相關（P＜0.01），瘤胃球菌科與可溶性固形物/總酸呈極顯著負相關（P＜0.01），與氨基酸態氮呈顯著正相關（P＜0.05），腸桿菌科和丹毒絲菌科與食鹽含量分別呈極顯著、顯著負相關（P＜0.01）、（P＜0.05）。綜上，在紅酸湯發酵過程中，對其細菌群落結構組成有顯著影響的理化指標是食鹽、pH、可溶性固形物/總酸和氨基酸態氮。食鹽含量對腸桿菌科和丹毒絲菌科影響顯著，食鹽含量越高，腸桿菌科和丹毒絲菌科生長受到抑制。pH值對乳桿菌科呈正向影響，pH值與鏈球菌科、Muribaculaceae呈負向影響，可溶性固形物/總酸對Muribaculaceae、普氏菌科、瘤胃球菌科呈負向影響。氨基酸態氮含量越高，瘤胃球菌科占比越高，食鹽含量對腸桿菌科和丹毒絲菌科呈負向影響。

由圖4B可知，枝孢霉科與食鹽含量呈顯著正相關（P＜0.05），酵母科與pH值呈顯著正相關（P＜0.05），假毛殼菌科與pH值呈極顯著負相關（P＜0.01），曲霉科與氨基酸態氮呈顯著正相關（P＜0.05）。在紅酸湯發酵過程中，食鹽、pH值和氨基酸態氮也是推動真菌菌落結構組成的重要因素。

3 結論

樣品ND品質較優，其總酸、還原糖、可溶性固形物含量、pH值、氨基酸態氮含量較高，分別為2.59%、1.70%、12.80%、3.36、0.08%，食鹽含量、可溶性固形物/總酸最低，分別為2.97%、4.94；6個紅酸湯樣品共計檢測出22個細菌門，193個細菌科，10個真菌門，132個真菌科。真菌的豐富度和多樣性差異不大，細菌有較大差異，這可能與食鹽、酸度等發酵條件和溫度、氣候等發酵環境的差異有關；通過Spearman算法得出pH值、食鹽、氨基酸態氮含量及可溶性固形物/總酸與其中7個細菌科、4個真菌科呈顯著相關（P＜0.05）。在紅酸湯發酵過程中，以pH值、可溶性固形物/總酸、食鹽、氨基酸態氮為主的理化指標是推動紅酸湯微生物群落構建的重要因子，也是影響紅酸湯品質的重要因素。