韭黃發酵前后揮發性風味成分及游離氨基酸變化分析

國光梅，李立郎，魏福曉，周 美，王 麗，李齊激，安正斌，楊小生，王 瑜*

（1.貴州省天然產物研究中心，貴州 貴陽 550014；2.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014）

韭黃（Allium senescens）又名黃韭、韭菜白，屬百合科多年生草本植物[1]，為韭菜通過培土、遮光覆蓋等措施，在不見光的環境下經軟化栽培后的黃化韭菜[2]，具有特殊的強烈氣味，是我國重要的蔥類蔬菜之一。韭黃含豐富的蛋白質、維生素、礦物質、甙類和苦味物質，味道鮮美，能促進食欲[3-4]。韭黃性溫，味辛，《本草綱目》記載，韭黃具有固腎縮尿之功效；此外，韭黃含有特殊的揮發性精油，有助于疏調肝氣，增強消化功能；韭黃的辛辣氣味有散瘀活血，行氣導滯作用，用于治療跌打損傷、吐血、胸痛等癥狀[5]。目前，韭黃初加工產生的廢棄物量大，且這部分廢棄物主要作為有機肥發酵原料進行處理，這是對優質資源的極大浪費。因此，亟需對韭黃副產物開展精深加工，提高其經濟附加值，延伸產業鏈。

以新鮮蔬菜為原料的微生物發酵產品由于含有豐富的營養成分，具有抗氧化、調節腸道菌群等多種功能而備受關注[6]。在發酵過程中，微生物通過自身的生長和代謝作用，使底物產生一系列的生物化學變化，得到的發酵產物不僅保留了底物特有的風味和營養成分，還能使風味和口感得到明顯改善[7]。維持人體健康的營養成分游離氨基酸，可被人體直接吸收利用，不僅可以增強機體新陳代謝、提高免疫力，同時參與氮代謝作用[8-9]，也可與口腔中的味蕾結合產生酸、甜、苦、鮮或咸等滋味[10]，揮發性風味成分則是評價發酵液風味的重要指標[11]。目前，有關韭黃中氨基酸的呈味特性和營養價值評價的報道較少，本研究以新鮮韭黃為原料，加入白砂糖、活性干酵母菌粉，經過恒溫發酵制備具有抗疲勞、滋陰補腎的微生物發酵產品。采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技術分析韭黃發酵前后揮發性成分的變化，采用氨基酸自動分析儀分析韭黃發酵前后游離氨基酸種類及含量變化，并通過滋味強度值（taste activity value，TAV）篩選其特征呈味物質，以期為韭黃精深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮韭黃：安順普定縣韭黃種植基地；纖維素酶（20 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品級）：云南文山英茂糖業有限公司。

氨基酸混合標準溶液濃度為100 nmol/L（磷酸絲氨酸、?；撬帷⒘滓掖及?、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、α-氨基己二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基異丁酸、γ-氨基丁酸、組氨酸、3-甲基組氨酸、1-甲基組氨酸、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、氨、精氨酸、尿素、肌肽、羥脯氨酸和脯氨酸）：德國SYKAM公司。

檸檬酸-檸檬酸鋰緩沖液的pH分別為2.90、4.20、8.00。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C GC-MS聯用儀、HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；57333-U固相微萃取裝置：美國Supelco公司；SKG-PB-936型打漿機：上海達瑞寶食品機械有限公司；AG285型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；S433D型全自動氨基酸分析儀：德國SYKAM公司；Millipore-0026型超純水機：美國默克密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 韭黃發酵液的制備

酵母粉活化：采用10%的白糖水，按總質量0.01%添加安琪活性干酵母粉，在32 ℃的恒溫水浴鍋中攪拌均勻，活化15 min，待用。

菌酶混合發酵：根據前期預實驗結果，將韭黃破碎液冷卻溫度降至40～45 ℃時，按其總質量的0.02%添加纖維素酶，45 ℃恒溫條件下酶解2 h，加入活化好的酵母菌種液，控制發酵溫度在25～30 ℃，有氧發酵15 d，至韭黃發酵液澄清度、發酵液的糖度≤5°Bx即完成發酵，得韭黃發酵液。

1.3.2 揮發性風味成分分析

揮發性風味成分分析采用HS-SPME-GC-MS法。

前處理條件：新鮮韭黃發酵前后的樣品經0.45μm微孔濾膜過濾后，稱取5g，精密加入內標溶液3 μL（環己酮質量濃度為5.350 9 mg/mL，壬酸甲酯質量濃度為1.836 5 mg/mL）置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMSStableFlex纖維頭的手動進樣器，在60℃、150r/min磁力加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解吸3 min進樣。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（60m×0.25mm×0.25μm），升溫程序為初始溫度42 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升溫至208 ℃，以10 ℃/min升溫至310 ℃，保持2 min，運行時間61.43min；汽化室溫度230℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓15.98 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比10∶1，溶劑延遲時間3 min。

質譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 635 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。

定性定量方法：各峰經質譜計算機數據系統檢索，并通過比對美國國家標準技術研究所（national Institute of standards and technology，NIST）20和Wiley 275標準質譜圖，對揮發性風味成分定性。揮發性風味物質的定量測定采用內標半定量法[12]，各揮發性風味物質含量計算公式如下：

式中：C2-待測風味組分質量濃度，mg/kg；C1-內標質量濃度，mg/mL；S2-待測風味組分峰面積；S1-內標物峰面積；V內-內標物體積，mL；V樣-樣品取樣量，mL。

1.3.3 游離氨基酸分析

游離氨基酸含量測定采用氨基酸分析儀。

稱取新鮮韭黃樣品100 g置于打漿機中打漿5 min后，稱取10 g勻漿液，加體積分數為75%乙醇50 mL，超聲提取20 min，過濾，減壓回收乙醇，用10 mL乙醚萃取，水層蒸干，加0.02 mol/L HCl定容至10 mL，精密量取0.25 mL置于5 mL容量瓶中，定容、搖勻。韭黃發酵液樣品：取1 mL樣品，加9 mL 1%磺基水楊酸定容至10 mL，10 000 r/min離心10 min、用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液按照氨基酸分析儀器工作條件測定。

1.3.4 滋味強度值

滋味強度值（TAV）可以表示該物質對樣品呈味特征的貢獻度[8]，游離氨基酸的TAV計算公式如下：

式中：C為滋味物質的質量濃度，mg/g；T為滋味物質的呈味閾值，mg/g。

2 結果與分析

2.1 韭黃揮發性風味成分分析

韭黃發酵前、后樣品的揮發性風味成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1，各揮發性風味成分檢測結果見表1。

表1 韭黃發酵前后樣品中揮發性風味成分GC-MS分析結果Table 1 Results of volatile flavor components in Allium senescens samples before and after fermentation analyzed by GC-MS

圖1 韭黃發酵前（a）、后（b）樣品中揮發性風味成分GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile flavor components in Allium senescens samples before (a) and after (b)fermentation analyzed by GC-MS

由表1可知，在韭黃發酵前樣品中共檢出74種揮發性風味成分，包括有機硫類40種、醛類16種、酯類7種、酸類1種、醇類3種和其他類7種，其中有機硫類含量最高；發酵后韭黃樣品中共檢出76種揮發性風味成分，包括有機硫類17種、醛類11種、酯類32種、酸類5種、醇類4種和其他類7種，其中酯類含量最高。

2.1.1 有機硫類物質

有機硫化合物是蔥屬植物的主要風味物質，賦予了蔥屬蔬菜極大的營養和藥用價值。YABUKI Y等[13]研究表明，韭菜中主要以甲硫氨酸產生的二甲基二硫化物和二甲基三硫化物為主，其次是蒜氨酸產生的二烯丙基二硫和烯丙基1-（E）-丙烯基二硫化物。韭菜類似于大蒜的獨特的辛辣香氣是由于組織被碾碎或切碎時，通過蒜氨酸酶對半胱氨酸亞砜（cysteine sulfoxide，CSO）酶促降解，從而迅速產生具有獨特氣味的揮發性化合物[14]。通過檢測結果可以看出，韭黃發酵前后有機硫化合物含量較高的主要是二甲基三硫、二甲基二硫、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚、甲基烯丙基三硫醚。發酵后韭黃樣品中有機硫類物質的種類和含量顯著降低，發酵前韭黃樣品中共檢出有機硫類物質有40種，總含量高達197.754 mg/kg；發酵后韭黃樣品中共檢出有機硫類物質17種，總含量低至142.897 mg/kg。研究發現，微生物發酵能有效去除蔥屬植物的辛辣味及刺激性臭味，以改善口感，且在發酵過程伴隨著有機硫化物的轉變，這些硫化物的降解與生成可能來自于本身的酶促反應，或者美拉德的非酶反應，也可能來自于微生物對硫化物的利用[15]，韭黃發酵后有機硫類物質可能降解為酯類、醇類等香氣物質。

2.1.2 醛類物質

醛類物質主要來源于原料中脂肪酸的氧化和蛋白質的Strecker降解反應，閾值較低，對風味的貢獻較大[16]，韭黃的發酵過程是醛類物質向醇類物質和酸類物質的轉變。發酵后韭黃中新增了正辛醛、葵醛、壬醛，均是油酸的氧化產物。其中正辛醛具有玫瑰和橙皮香味，壬醛具有玫瑰柑橘香味，是油酸的氧化產物。發酵前韭黃樣品中共檢出醛類物質有16種，總含量為31.986 mg/kg，其中巴豆醛含量高達20.547 mg/kg，發酵后韭黃樣品中共檢出醛類物質有11種，總含量為9.935 mg/kg，未測出巴豆醛。這些變化主要是因為發酵后通過乳酸菌、醋酸菌等能夠產酸的細菌代謝形成，且醛類物質在發酵過程中被還原形成醇類物質，因此賦予發酵產品獨特的香味。

2.1.3 酯類物質

酯類物質是醇與羧酸和氨基酸發生酯化反應的產物，大多數酯類具有令人愉悅的花果香[17]。發酵前韭黃樣品中共檢出酯類物質7種，總含量為0.078 mg/kg；發酵后韭黃樣品中共檢出酯類物質32種，總含量為80.843mg/kg，韭黃經發酵后含量較高的酯類化合物分別為辛酸乙酯（44.542 mg/kg）、乙酸乙酯（21.937 mg/kg）、正己酸乙酯（3.163 mg/kg）。其中辛酸乙酯具有果香、乙酸乙酯具有似菠蘿、蘋果和香蕉的水果香氣，正己酸乙酯具有果香、甜香[18]，說明韭黃發酵后，酯類物質的種類和含量顯著增加，風味也得到了一定程度的改善。

2.1.4 酸類物質

酸類物質的含量和種類取決于營養物質含量和酵母的使用[19]，微生物發酵的代謝途徑主要有醋酸、乙醇、乳酸、檸檬酸發酵，前期糖代謝可以為微生物提供發酵原料。發酵前韭黃樣品中共檢出1種棕櫚酸，含量為0.014 mg/kg；韭黃發酵后樣品中共檢出酸類5種，總含量高達72.363 mg/kg。其中醋酸含量為48.765 mg/kg，辛酸含量為23.406 mg/kg。在酵母菌的發酵下，好氧型的醋酸菌能將乙醇轉化為醋酸，另外乳酸菌發酵也可能產生醋酸[20]，所以新增了大量的醋酸。適量的酸味可賦予食品舒適、柔和的口味，與酯類、醇類物質含量配比恰當，有助于樣品的呈香。

2.1.5 醇類物質

韭黃的發酵過程是醛類物質向醇類物質和酸類物質的轉變。醇類物質是由酵母菌分解糖或氨基酸脫氨的代謝產物產生，賦予產品花香和水果香[21]，對風味具有重要作用。相對于新鮮韭黃，韭黃發酵液中醇類物質中的乙醇、芳樟醇、異戊醇含量大幅提高，其中乙醇含量最高（650.290 mg/kg）。在酵母菌的發酵下，乙醛被還原為乙醇，實現了醛類物質向醇類物質的轉變，韭黃發酵后樣品中共檢出醇類物質4種，總含量為673.390 mg/kg。其中芳樟醇具有花香味，異戊醇具有水果香、酒香味[22]，均對韭黃發酵液風味帶來積極的作用。

2.2 韭黃發酵前后游離氨基酸含量分析結果

2.2.1 游離氨基酸檢測結果分析

35種氨基酸混合標準溶液與韭黃發酵前后樣品的游離氨基酸檢測色譜圖見圖2。

圖2 氨基酸混合標準液（a），發酵前（b）、后（c）韭黃樣品中游離氨基酸檢測色譜圖Fig.2 Chromatograms of free amino acids in amino acid mixed standard solution (a), Allium senescens samples before (b)and after (c) fermentation

2.2.2 游離氨基酸呈味特征和滋味強度值分析

食物中所含氨基酸由兩部分組成，一是作為蛋白質基本結構的非游離氨基酸，另一部分是處于游離狀態的氨基酸。非游離氨基酸在食用過程中并不能立即水解，對食品的滋味貢獻不大，因此研究氨基酸對食品滋味的貢獻時，有必要測定游離氨基酸的組成與含量[23-25]。氨基酸在結構上的差別取決于側鏈基團的不同，這一差別也影響了氨基酸的口味感官。按照氨基酸的味覺強度，可以大致把氨基酸分為甜味氨基酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His）、苦味氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Trp、Arg）、鮮味氨基酸（Lys、Glu、Asp）、芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Cys）[26]。

根據各游離氨基酸閾值計算TAV，其值越大對樣品的呈味貢獻越大，反之亦然。當TAV＞1時，說明該呈味氨基酸對呈味有貢獻，而TAV＜1時，該呈味氨基酸對呈味貢獻不大，呈味作用不顯著[27-30]。韭黃發酵前后游離氨基酸含量、閾值、呈味特性及TAV見表2。

表2 韭黃發酵前后樣品中游離氨基酸含量、味道閾值、呈味特性及滋味強度值Table 2 Contents, taste thresholds, taste attributes and taste intensity value of free amino acids in Allium senescens before and after fermentation

由表2可知，韭黃發酵前樣品中共檢出游離氨基酸22種，其中包括8種必需氨基酸，必需氨基酸總含量為24.861 mg/g，甜味、苦味、鮮味、芳香族氨基酸含量分別為49.877 mg/g、13.398 mg/g、19.142 mg/g、7.154 mg/g。韭黃發酵后樣品中共檢出游離氨基酸21種，其中包括7種必需氨基酸，必需氨基酸總含量為5.013 mg/g，甜味、苦味、鮮味、芳香族氨基酸含量分別為19.269 mg/g、2.411 mg/g、9.763 mg/g、1.925 mg/g。

韭黃發酵前樣品中有17種呈味氨基酸的TAV＞1，韭黃發酵后樣品中有10種氨基酸的TAV＞1，7種氨基酸的TAV＜1。韭黃發酵前樣品中氨基酸滋味影響大小依次為半胱氨酸（Cys）＞丙氨酸（Ala）＞谷氨酸（Glu）＞纈氨酸（Val）＞組氨酸（His）＞賴氨酸（Lys）＞絲氨酸（Ser）＞天冬氨酸（Asp）＞精氨酸（Arg）＞苯丙氨酸（Phe）＞異亮氨酸（Ile）＞蘇氨酸（Thr）＞亮氨酸（Leu）＞蛋氨酸（Met）＞甘氨酸（Gly）＞脯氨酸（Pro）＞酪氨酸（Tyr）。韭黃發酵后樣品中氨基酸滋味影響大小依次為半胱氨酸（Cys）＞谷氨酸（Glu）＞丙氨酸（Ala）＞賴氨酸（Lys）＞甘氨酸（Gly）＞組氨酸（His）＞天冬氨酸（Asp）＞精氨酸（Arg）＞脯氨酸（Pro）＞絲氨酸（Ser）＞蛋氨酸（Met）＞纈氨酸（Val）＞苯丙氨酸（Phe）＞亮氨酸（Leu）＞蘇氨酸（Thr）＞酪氨酸（Tyr）＞異亮氨酸（Ile）。

在韭黃發酵前后樣品中，丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸含量較高，發酵前分別為23.808 mg/g、7.512 mg/g、4.449mg/g、2.437mg/g。發酵后分別為9.880mg/g、6.403mg/g、3.905 mg/g、2.801 mg/g。谷氨酸是食品中鮮味的呈味劑，丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸是甜味的呈味劑，它們對韭黃的滋味起著關鍵作用。韭黃中苦味氨基酸含量發酵后顯著降低，且發酵液中的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸4種苦味氨基酸含量均低于呈味閾值，可有效增強其他氨基酸的鮮味和甜味，由此可見，發酵后苦味氨基酸含量降低改善了韭黃發酵液的滋味。

除了影響滋味以外，氨基酸在維持人體健康方面具有非常重要的作用，如在新鮮韭黃和韭黃發酵液中含量較高的丙氨酸可增強記憶力以及學習的能力；谷氨酸通過調節突觸可塑性和神經回路功能從而發揮興奮中樞神經系統功能，此外，谷氨酸還參與消化系統、免疫系統的許多功能，被稱為“功能性氨基酸”；脯氨酸對維持皮膚和結締組織的健康生長非常重要；甘氨酸廣泛存在于人體結締組織中，對人體消化系統、神經系統有積極作用。這與韭黃具有抗疲勞、增強免疫、促進消化的傳統功效一致。

3 結論

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法（HS-SPME-GC-MS）和氨基酸分析儀對韭黃發酵前后樣品的揮發性風味成分和游離氨基酸進行測定，并通過滋味強度值（TAV）篩選特征呈味物質。結果表明，韭黃發酵前、后樣品中分別共檢出74種、76種揮發性風味成分。韭黃發酵液中有機硫類化合物相對含量顯著降低，醇類化合物相對含量增加，產生了讓人愉悅的酯類化合物，這是韭黃發酵液特殊風味減弱的主要原因。發酵前韭黃檢出游離氨基酸22種，必需氨基酸總含量為24.861 mg/g，甜味、苦味、鮮味、芳香族氨基酸含量分別為49.877 mg/g、13.398 mg/g、19.142 mg/g、7.154 mg/g。發酵后韭黃檢出游離氨基酸21種，其中包括7種必需氨基酸，必需氨基酸總含量為5.013 mg/g，甜味、苦味、鮮味、芳香族氨基酸含量分別為19.269 mg/g、2.411 mg/g、9.763 mg/g、1.925 mg/g。韭黃發酵液中苦味氨基酸的含量顯著降低，改善了發酵液的滋味。通過系統的分析韭黃發酵前后風味、滋味的變化，可為韭黃精深加工提供基礎支持。