核桃粕納豆發酵工藝優化及其品質分析

孫 娜，朱秀娟，何九軍，謝曉娟，何紅蕾

（1.隴南師范高等專科學校 農林技術學院，甘肅 隴南 742500；2.隴南特色農業生物資源研究開發中心，甘肅 隴南 742500）

納豆（Natto）起源于中國古代，具有黏性，氣味較臭，味道微甜，富含納豆激酶、維生素、異黃酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物質，是一種具有良好營養保健功能的優質食品資源[1-2]。納豆激酶（Nattokinase，NK）是一種安全溶栓的天然物質，具有抑制血小板凝固的作用，其半衰期長、特異性強、副作用小、可直接口服，在預防和治療心腦血管栓塞癥等方面起到積極作用[3-4]。我國現有心血管疾病患病人數約為3.3億人，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致殘的首要原因[5-6]，因此開發以納豆激酶為核心的保健食品，擴大其臨床和商業的應用是符合《國民營養計劃（2017—2030）》，為改善我國居民營養狀況、提高人群整體健康水平提供重要政策支撐和保障[7]。

低溫核桃粕是核桃油冷榨生產工藝過程中產生的一種副產物[8-9]，具有核桃清香味，是一種良好的植物蛋白資源，蛋白質含量高達30%～40%，還富含礦物質、膳食纖維及多酚等營養物質[10]，可以為發酵菌株提供充足的氮源和碳源，因此在食品固態發酵研究中應用廣泛。王宸軒等[11]以核桃粕為原料，研究了核桃粕固態發酵醬油的最佳工藝；高瑞雄等[12]以冷榨核桃粕為原料，研究了固態發酵制備納豆激酶的最佳工藝。但目前關于低溫核桃粕納豆發酵研究還鮮有報道。

本研究以核桃粕與黃豆為原料，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵制備核桃粕納豆，采用單因素及響應面試驗對固態發酵工藝進行優化，不僅有利于傳統納豆的風味改良和質量提升，而且為核桃粕和黃豆深加工提供了新方向，對核桃粕和黃豆資源開發和利用十分有意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫核桃粕：甘肅隴小南電子商務有限公司；黃豆：市售；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：隴南師專農林技術學院實驗室；尿激酶（10 000 U/mg）、凝血酶（2 000 U/mg）、纖維蛋白原（牛血）等試劑：黑龍江迪龍制藥有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型氣質聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美國安捷倫科技有限公司；UV2600紫外可見分光光度計：島津國際貿易（上海）有限公司；LS-35L立式壓力蒸汽滅菌機：山東創美機械科技有限公司；DH3600電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃粕納豆加工工藝流程及操作要點

操作要點：選取粒徑約6 mm左右的小粒黃豆和完整低溫核桃餅粕，剔除有破損、霉變和蟲蛀的不完整豆粒和核桃粕，用流水沖洗附著在豆皮上和核桃粕上的雜質，分別按質量比1∶3加水浸泡過夜，瀝干水分。為了使核桃粕發酵充分，片狀或塊狀核桃粕還需粉碎，過100目篩。將上述處理過的黃豆和核桃粕，分別放入發酵瓶中，于121 ℃蒸煮30 min。將枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養基中，放置于37 ℃、170 r/min搖床培養24 h，即得發酵菌液。按照一定比例將蒸煮好的核桃粕均勻平鋪于培養皿底部，上面以黃豆覆蓋，冷卻至40 ℃左右，接入發酵菌液，晃動培養皿使黃豆和核桃粕均勻的裹上菌液。放入培養箱發酵24 h，取出置于冰箱后熟18 h，即得成品核桃粕納豆。

1.3.2 核桃粕納豆發酵工藝優化單因素試驗設計

通過單因素試驗設計，以綜合評價分為考察指標，分別考察核桃粕添加量（16%、18%、20%、22%、24%）、枯草芽孢桿菌接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、發酵溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、發酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）和后熟時間（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h）對核桃粕納豆品質的影響。

1.3.3 核桃粕納豆發酵工藝優化響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心組合試驗設計法，以核桃粕添加量（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為4個考察因素，以綜合評價分（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面試驗，優化核桃粕納豆發酵工藝。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 核桃粕納豆發酵工藝優化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

1.3.4 測定方法

感官評價：由10名感官培訓人員組成評價小組，對核桃粕納豆從拉絲、氣味、色澤和口感四個方面進行感官評價，并取其平均值。核桃粕納豆感官評價標準見表2（滿分100分）。

綜合評價：參照付文靜[13]的綜合評價法，感官評分和納豆激酶酶活兩指標各占50%權重。其計算公式如下：

感官指標分析：參照SB/T 10528—2009《納豆》[14]和T/CNLIC 0036—2021《納豆》[15]對核桃粕納豆進行感官分析。

核桃粕納豆水分、蛋白質、氨基酸態氮和納豆激酶活力的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[16]、GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[17]、GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》[18]及分光光度法[13]。

揮發性物質測定：

樣品預處理：稱取均勻研碎的核桃粕納豆樣品3.00 g于15 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超純水，插入已老化的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纖維頭，在溫度50 ℃，轉速500 r/min的條件下預熱樣品15 min，將萃取頭插入進樣口于250 ℃解吸3 min。

GC條件：載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流進樣；氣化室溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，恒溫2 min，以5 ℃/min的升溫速率升高到150 ℃，再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min[19-20]。

定性定量方法：對檢測出的成分采用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）11數據庫自動檢索化合物的質譜數據，參考標準光譜圖進行定性分析；采用面積歸一化法定量。

1.3.5 數據統計與分析

采用Microsoft office Excel 2016軟件和Design Expert 10軟件對數據進行分析處理，每組試驗平行測定3 次。

2 結果與分析

2.1 核桃粕納豆發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 核桃粕添加量對納豆品質的影響

由圖1可知，隨低溫核桃粕添加量的增加，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。當核桃粕添加量為20%時，綜合評價達到最大值，為81.3分。這可能是因為隨著核桃粕添加量的不斷增加，核桃粕特有的清香味，在一定程度上提升了納豆的感官品質；但當核桃粕添加量過高時，因其顆粒度較小，會附著在黃豆表面，減少枯草芽孢桿菌與黃豆的直接接觸，導致納豆激酶活力降低。因此，選擇最佳核桃粕添加量為20%。

圖1 核桃粕添加量對核桃粕納豆品質的影響Fig.1 Effect of walnut meal addition on the quality of walnut meal natto

2.1.2 枯草芽孢桿菌接種量對納豆品質的影響

由圖2可知，隨枯草芽孢桿菌接種量的增加，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后緩慢降低的趨勢。當接種量＜1%時，核桃粕納豆表面附著的白膜少、拉絲短，納豆激酶酶活低，這可能是因為接種量不足導致底物發酵不徹底造成的；當接種量為1%時，納豆表面附著的白膜增多、拉絲變長，納豆激酶酶活也顯著增高，綜合評價達到最大值，為80.3分；當接種量＞1%時，隨著接種量的增加，納豆表面附著的白膜不再增多，拉絲不再變長，且納豆表面失水出現褶皺現象，導致納豆感官品質下降，這可能是因為接種量越高，枯草芽孢桿菌繁殖越快，底物消耗力度大，發酵時間就會縮短，枯草芽孢桿菌生長到一定階段，菌體原生質失水形成橢圓形倒柱狀的內生孢子，出現褶皺現象。因此，選擇最佳枯草芽孢桿菌接種量為1%。

紅軍在雪山草地籌糧過程中，先后采取了一系列的措施。一、號召節約糧食，嚴格擬定糧食分配計劃；加緊糧食宣傳工作，動員群眾將自己的糧食和食物支援紅軍。二、繳獲戰利品。三、通過蘇維埃政府沒收劣紳、地主的糧食。四、向商人和當地群眾購買糧食。五、運走藏匿在老百姓家的糧食和窖藏，留下銀元或欠條，收割地里成熟的青稞、小麥等，插上木板借條。

圖2 枯草芽孢桿菌接種量對核桃粕納豆品質的影響Fig.2 Effect of Bacillus subtilis inoculum on the quality of walnut meal natto

2.1.3 發酵溫度對納豆品質的影響

由圖3可知，隨發酵溫度的升高，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。隨著發酵溫度的不斷提高，納豆表面附著的白膜逐漸增多，納豆激酶活力不斷升高；當發酵溫度達到40 ℃時，綜合評價分達到最大值，為96.0分；繼續升高發酵溫度，納豆表面附著的白膜不再增多反而減少，納豆激酶活力也開始下降。這可能是因為在適宜的溫度條件下，枯草芽孢桿菌生長旺盛，利于納豆發酵。當發酵溫度過低或過高時，都會影響枯草芽孢桿菌的生長繁殖[22]。因此，選擇最佳發酵溫度為40 ℃。

圖3 發酵溫度對核桃粕納豆品質的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of walnut meal natto

2.1.4 發酵時間對納豆品質的影響

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，核桃粕納豆綜合評價分呈先升高后降低的趨勢。當發酵時間為24 h時，綜合評價分達到最大值，為96.0分。當發酵時間較短時，枯草芽孢桿菌活菌數不足，納豆表面白膜較少，納豆激酶活力低，發酵不充分；當發酵時間過長時，營養物質減少，環境的載菌量不足以承受較多的芽孢，枯草芽孢桿菌菌體逐漸進入衰亡期，亦不利于發酵[23]。因此，選擇最佳發酵時間為24 h。

圖4 發酵時間對核桃粕納豆品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of walnut meal natto

2.1.5 后熟時間對納豆品質的影響

由圖5可知，隨著后熟時間的延長，核桃粕納豆綜合評價分呈先上升后緩慢下降的趨勢。當后熟時間為20 h時，綜合評價分達到最大值，為90.5分。這可能是因為納豆激酶極不穩定，會隨著后熟時間的延長發生轉化或降解；亦或是后熟過程中產生了特殊的活性物質，對納豆激酶的活性產生了抑制作用所致[24]。因此，選擇最佳后熟時間為20 h。

圖5 后熟時間對核桃粕納豆品質的影響Fig.5 Effect of post ripening time on the quality of walnut meal natto

2.2 核桃粕納豆發酵工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果分析，運用Box-Behnken響應面優化方法，對表3試驗數據進行多元非線性擬合，擬合回歸方程為：

表3 核桃粕納豆發酵工藝優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

2.2.2 回歸模型方差分析

由表4可知，模型F值為23.35，P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項（P=0.075 1＞0.05）不顯著，說明模型選擇準確。決定系數R2=0.958 9，調整決定系數R2Adj=0.917 9，說明此模型和實際實驗擬合較好。預測的核桃粕納豆最佳發酵工藝為核桃粕添加量20.5%、接種量1.2%、發酵溫度40.9 ℃、發酵時間27 h和后熟時間20 h。此條件下的核桃粕納豆綜合評價預測值為95.0分。在此條件下進行3次平行驗證試驗，試驗測得綜合評價實際值為94.3分，二者數值接近，說明模型預測所得最佳發酵工藝可用于核桃粕納豆實際生產。

表4 Box-Benhnken試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Benhnken tests results

2.2.3 響應面分析

對核桃粕添加量（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）4個因素兩兩作交互作用分析，對其作響應曲面及等高線，結果見圖6。響應曲面越陡峭，說明影響越顯著；曲面越平坦，說明影響越小[25-27]。由圖6可知，核桃粕添加量與發酵溫度之間（AC）、發酵溫度與發酵時間（CD）之間的交互作用強，響應曲面呈凸形，拋物面更陡峭。

圖6 各因素間交互作用對核桃粕納豆綜合品質影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the comprehensive quality of walnut meal natto

2.3 產品品質分析

2.3.1 感官指標分析

依據SB/T 10528—2009《納豆》和T/CNLIC 0036—2021《納豆》感官要求對產品進行檢驗，結果表明核桃粕納豆色澤呈茶褐色，表面均勻覆蓋一層白色菌膜，具有納豆特有氣味，攪拌時有黏性強，拉絲長，且豆粒完整，軟硬適當。

2.3.2 理化指標分析

由表5可知，各項理化指標均符合納豆商業標準要求。

表5 核桃粕納豆理化指標檢測結果Table 5 Physicochemical indexes determination results of walnut meal natto

2.3.3 揮發性物質測定

由表6可知，核桃粕納豆由HS-SPME-GC-MS分析鑒定出的揮發性物質主要有烴類22種（24.8%）、醇類9種（36.0%）、酯類8種（36.0%）、醚類1種（1.9%）、酮類1種（0.7%）、雜環化合物2種（0.6%）。上述揮發性物質共同構成了核桃粕納豆獨特的風味。核桃粕納豆中主要的揮發性風味物質有2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等。2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯屬于酯類化合物，具有花椒油的氣味[28]；芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，具有鈴蘭特征的花香氣味[29]；4-萜烯醇屬于天然單萜類化合物，具有較淡的泥土香和陳腐的木材氣味[30]；石竹烯屬于雙環倍半萜類化合物，具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香及溫和的丁香香氣[31]。與傳統納豆風味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊異臭味的揮發性物質相對減少[32]，核桃粕與黃豆共發酵起到了改善不良風味的作用，這可能是因為核桃粕原料本身或二者共發酵相互作用所致。

表6 核桃粕納豆揮發性物質分析Table 6 Analysis of volatile substances in walnut meal natto

3 結論

以核桃粕和黃豆為原料，選取枯草芽孢桿菌為發酵菌種制備核桃粕納豆。采用單因素和Box-Behnken試驗得到最佳發酵工藝條件為核桃粕添加量20.5%、接種量1.2%、發酵溫度40.9 ℃、發酵時間27 h和后熟時間20 h。在此條件下，發酵所得納豆呈茶褐色，拉絲長，氨味低，納豆激酶活力高。通過HS-SPME-GC-MS分析核桃粕納豆揮發性物質成分，結果表明，核桃粕納豆主要成分為2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等，這些化合物共同賦予核桃粕納豆獨特風味，與傳統納豆風味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊異臭味的揮發性物質也相對減少。本研究在保留納豆營養價值的基礎上，降低了氨臭味，對核桃粕納豆的工業化生產可以提供一定的參考依據。