醬香型白酒丟糟中多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析

李芳香，徐麗娜，宋露露，賀國君，周曉秋，岳倩倩，謝 藝*

（1.茅臺學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564501）

醬香型白酒丟糟是以紅纓子高粱、赤水河水和高溫大曲為原料，在多種霉菌、酵母、細(xì)菌和放線菌作用下，于長達(dá)一年的時(shí)間里經(jīng)過九次蒸煮，八次發(fā)酵和七次蒸餾取酒后剩余的固體殘?jiān)黐1-2]。鮮丟糟營養(yǎng)物質(zhì)含量高，易酸化腐敗，不易保存，對環(huán)境造成較大污染[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過“多微、多酶共酵”后的醬香型丟糟中含有大量的高附加值活性物質(zhì)，主要包括蛋白（肽）類、多酚類、黃酮類等。通過提取、分離和純化分析研究提取丟糟中的生物活性物質(zhì)，如多酚、糖類和蛋白等，發(fā)現(xiàn)其中多酚是醬香型白酒具有獨(dú)特口感和香味特征的原因之一[5]，通過進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)特性和藥學(xué)特性進(jìn)行研究，可有效提高丟糟的二次高效利用，實(shí)現(xiàn)釀酒企業(yè)的資源最大化利用。

多酚類主要包括單寧、香豆素（酸）類、黃酮類和酚酸類等，具有一定的抗氧化、消炎、抗病毒和維持腸道健康的能力[6-10]，廣泛應(yīng)用于化妝品和保健品行業(yè)，并得到藥學(xué)領(lǐng)域的重視[11-12]。目前提取多酚類物質(zhì)主要是從植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中提取，其來源有限且含量相對固定[13-17]。常用提取多酚的方法主要有超聲波提取法、酶解法、微波提取法和溶劑萃取法等[18-19]。選取不同的方法提取多酚，對多酚的提取活性和提取率都有一定的影響[20-21]。微波輔助乙醇浸提法具有穿透性較強(qiáng)，對多酚類等熱敏性物質(zhì)友好等特點(diǎn)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，從酒糟中提取多酚類物質(zhì)研究較少，曹新志等[23]研究了乙醇熱回流提取郎酒酒糟中多酚的工藝條件并對其提取方法和檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，謝雨尋等[24]研究了水浴振蕩法提取茶多酚的最優(yōu)工藝條件并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究，然而，鮮有關(guān)于醬香型白酒丟糟多酚的提取工藝及其生物活性方面的研究報(bào)道。

本研究通過微波輔助乙醇浸提醬香型白酒丟糟中的多酚類物質(zhì)，以多酚得率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對丟糟中多酚類物質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對其抗氧化能力進(jìn)行測定。以期開發(fā)富含多酚類調(diào)味酒的原料，為制備富含多酚類調(diào)味酒提供物質(zhì)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型丟糟：產(chǎn)自貴州仁懷某酒廠。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、水楊酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司；福林酚試劑（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵、硫酸亞鐵（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。所用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR-3E常壓微波合成萃取儀：上海勒頓實(shí)業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、DGG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZK-300A小高速萬能粉碎機(jī)：北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司；UV5100紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；3K15離心機(jī)：美國SIGMA公司；XMTD203恒溫水浴鍋：江蘇中大儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醬香型白酒丟糟中多酚的提取

將醬香型白酒丟糟置于50 ℃的恒溫箱中干燥至恒定質(zhì)量，并用萬能粉碎機(jī)粉碎，過80目篩備用。

準(zhǔn)確稱取5.000 g醬香型白酒酒糟干粉末，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比為1∶20（g∶mL）、微波功率為300 W、微波時(shí)間150 s的條件下，對醬香型白酒酒糟中的多酚進(jìn)行提取。

1.3.2 醬香型白酒丟糟中多酚的測定及計(jì)算

采用分光光度法測定醬香型白酒丟糟中多酚含量[25-26]。分別移取0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、3.0mL的0.1mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于6個(gè)100 mL的容量瓶中，分別加入1.0 mL福林酚試劑，振蕩搖勻后加入3.0 mL 10%Na2CO3溶液，充分搖勻后定容到100 mL，于20 ℃下避光反應(yīng)80 min后，以不含有沒食子酸溶液作空白對照，于波長765 nm條件下測定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性回歸方程為Y=48.554X+0.024 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

根據(jù)曹新志等[23]提供的方法測定樣品中多酚的含量，并根據(jù)沒食子酸線性回歸方程計(jì)算多酚的含量。醬香型白酒丟糟多酚得率計(jì)算公式如下：

式中：W為多酚得率，mg/g；C為多酚含量，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)，100；M為丟糟的質(zhì)量，g。

1.3.3 醬香型白酒丟糟多酚提取條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：分別探究料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）、提取時(shí)間（60 s、90 s、120s、150 s、180 s）和提取功率（200 W、250 W、300 W、350W、400 W）對多酚得率的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果綜合考慮，確定料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、微波功率（D）4個(gè)影響因素，以多酚得率為評價(jià)指標(biāo)，建立4因素3水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化微波輔助乙醇提取丟糟中多酚工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 多酚提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polyphenols extraction process conditions optimization

1.3.4 醬香型白酒丟糟中多酚提取液的羥基自由基清除能力

根據(jù)唐婷范等[27-28]的方法，略有修改。向試管中依次加入1 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2 mL的9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、3 mL的蒸餾水，再加入2 mL的8.8 mmol/L H2O2混合均勻后暗處靜置30 min，以不加H2O2為空白（以2.0 mL蒸餾水替代H2O2為空白），用水定容到10 mL比色管中，在波長510 nm的條件下測得吸光度值（A0），另取試管依次加入1.0 mL的9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2 mL的9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、3 mL不同濃度的丟糟提取液后，再加入2 mL 8.8 mmol/L的H2O2混合均勻后暗處靜置30 min，用水定容到10 mL比色管中，以蒸餾水作參比溶液，在波長510 nm的條件下測定吸光度值（A1），按上述條件在加入不同濃度的丟糟提取液后不加2 mL 8.8 mmol/L的H2O2（以2.0 mL蒸餾水替代H2O2為空白），用水定容到10 mL比色管中，測定吸光度值（A2），平行測定3次求平均值，羥自由基清除率公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的確定

圖1 料液比對丟糟多酚得率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the yield of polyphenols in distiller's grains

當(dāng)料液比為1∶10、1∶15（g∶mL）時(shí)，多酚得率逐漸增加；當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)，多酚得率達(dá)到最高值，為12.45%；當(dāng)料液比為1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）時(shí)，丟糟多酚得率呈現(xiàn)下降趨勢。主要原因可能是當(dāng)料液比達(dá)到一定程度時(shí)，適當(dāng)?shù)娜軇┯昧浚谝欢ǔ潭壬咸岣吡藖G糟固體和提取液體溶劑之間的傳質(zhì)推動(dòng)力，且增大了固體丟糟與液體的接觸面積，使丟糟多酚充分溶解，有利于酚類物質(zhì)的充分溶出；溶劑量過多，對溶出的多酚物質(zhì)起到一定的稀釋作用[29]。因此，確定最適料液比為1∶15（g∶mL）。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

乙醇體積分?jǐn)?shù)對丟糟中多酚得率影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～80%時(shí)，丟糟中多酚得率逐漸增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，為11.87%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80～100%時(shí)，多酚得率逐漸下降。多酚物質(zhì)主要通過氫鍵和疏水鍵與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合形成穩(wěn)定性化合物[30]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)增大時(shí)，溶劑的極性變小，有利于低極性的多酚物質(zhì)的溶出。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞80%時(shí)，隨著極性的不斷降低，其氫鍵被破壞，更多依靠氫鍵結(jié)合的物質(zhì)被破壞，更多雜質(zhì)被溶出，使多酚的穩(wěn)定性受到影響，導(dǎo)致多酚含量下降[31]。因此，確定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對丟糟多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols in distiller's grains

2.1.3 提取時(shí)間的確定

提取時(shí)間對多酚得率的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為60～150 s時(shí)，丟糟中多酚得率逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間為150 s時(shí)，丟糟中多酚得率達(dá)到最大值，為12.33%；當(dāng)提取時(shí)間＞150 s，丟糟中多酚得率趨于穩(wěn)定。其原因可能是，隨著提取時(shí)間的不斷增加，能更充分的將丟糟中的多酚物質(zhì)溶出；提取時(shí)間較長時(shí)，導(dǎo)致提取溫度升高，雜質(zhì)溶出不斷增多，多酚本身的穩(wěn)定性偏弱，易與雜質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，多酚遭到破壞而使多酚的含量下降[32]。因此，確定最適提取時(shí)間為150 s。

圖3 提取時(shí)間對丟糟多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols in distiller's grains

2.1.4 微波功率的確定

微波提取功率對丟糟中多酚得率的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)微波功率為200～250 W時(shí)，丟糟中多酚得率呈上升趨勢；微波功率為250 W時(shí)，丟糟中多酚得率達(dá)到最大值，為11.88%；微波功率＞250 W時(shí)，丟糟中多酚得率逐漸下降。其原因可能是，隨著微波功率的增加，固液系統(tǒng)升溫較快，細(xì)胞破碎加劇，更有利于多酚物質(zhì)的溶出，微波功率過高會造成體系升溫過快，使多酚結(jié)構(gòu)被破環(huán)[32]。因此，確定最適微波功率為250 W。

圖4 微波功率對丟糟多酚得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of polyphenols in distiller's grains

2.2 醬香型白酒丟糟多酚提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、微波功率（D）4個(gè)影響因素，以丟糟多酚得率為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 多酚提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polyphenols extraction process conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各種因素對醬香型白酒丟糟中多酚得率影響的主要次序?yàn)镃＞B＞A＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞微波功率。獲得提取工藝條件的最佳方案組合為A2B2C2D2，即料液比為1∶15（g∶mL）、提取時(shí)間為150 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、微波功率為250 W，因正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案未涉及此提取工藝條件，需要對此方案進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，在該優(yōu)化工藝條件下得到的醬香型白酒丟糟多酚得率為15.22%。表明該方案符合優(yōu)化結(jié)果，達(dá)到丟糟中多酚提取條件優(yōu)化的目的。

由表3可知，提取時(shí)間及乙醇提取分?jǐn)?shù)對醬香型白酒丟糟多酚得率影響顯著（P＜0.05），而料液比、微波功率對醬香型白酒丟糟多酚得率影響不顯著（P＞0.05），其原因很可能是醬香型白酒丟糟經(jīng)過多次蒸煮發(fā)酵，在多種微生物和酶的共同作用下，其多酚類物質(zhì)已經(jīng)溶出或者是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。

2.3 羥自由基清除能力檢測結(jié)果

羥自由基清除能力檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著VC溶液和多酚溶液質(zhì)量濃度在0～0.093 mg/mL范圍內(nèi)的增加，VC溶液和多酚提取液的羥自由基清除能力逐漸增加；當(dāng)VC溶液和多酚溶液質(zhì)量濃度＞0.093 mg/mL，羥自由基清除率變化趨于平穩(wěn)，當(dāng)多酚提取液的質(zhì)量濃度為0.116 mg/L時(shí)，其羥自由基清除能力達(dá)到最大值，為75.79%。因此，從醬香型白酒丟糟中提取出的多酚樣液具有羥基自由基清除能力。

圖5 丟糟多酚的羥自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging ability of polyphenols in distiller's grains

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以醬香型白酒丟糟為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探究了微波輔助乙醇浸提醬香型白酒丟糟中多酚的最佳提取工藝條件，并對其抗氧化能力進(jìn)行初步測定。結(jié)果表明，各種因素對醬香型白酒丟糟中多酚得率影響的主要次序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞微波功率，即當(dāng)料液比為1∶15，提取時(shí)間為150 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，微波功率為250 W時(shí)，丟糟多酚得率可達(dá)15.22%，羥基自由基清除率可達(dá)75.79%。結(jié)果表明，醬香型白酒丟糟中含有氧化還原能力較好的多酚類活性物質(zhì)，該優(yōu)化條件對醬香型白酒丟糟中高附加值活性物質(zhì)的提取具有重要指導(dǎo)意義，為富含多酚類調(diào)味酒的研制提供參考價(jià)值，為醬香型白酒丟糟的高效回收利用，減少環(huán)境污染，釀酒資源的循環(huán)高效利用提供參考思路。