翅萼石斛花在溫度脅迫下的轉錄組分析

陳宏宇 于 瑩

（1貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州貴陽 550025）

翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f）為蘭科石斛屬多年生草本植物，生長于海拔1 100～1 700 m 地區，在我國主要分布于云南等地[1-2]。翅萼石斛的花具有較高的觀賞價值，市場上翅萼石斛主要以野外采挖為主，導致野生資源數量銳減。

極端溫度是常見的非生物脅迫，對植物生長發育有著重要影響。低溫可引起細胞膜結構損傷，造成電解質外滲，氧化代謝平衡失調，活性氧積累，脂類過氧化[3]。低溫引起信號分子響應，通過基因轉錄調控一系列復雜的傳導過程，促使特定抗逆功能基因表達。功能基因可提高細胞內滲透調節物質、抗氧化能力和保護酶數量等，使植物產生耐受能力[4]。DREB/CBF（C-repeat binding factor）是AP2/乙烯應答因子DNA結合蛋白，是最早發現的低溫調控基因[5]。擬南芥中過表達CBF基因能提高低溫耐受特性[6]。類似的還有MAPK、鈣調蛋白、CDPK 和ICE轉錄因子等相關基因[7]。

氣候變暖導致高溫極端天氣增多，對植物產生不可逆轉的傷害。高溫脅迫會改變細胞膜的流動性和組分變化，內穩態失衡，影響DNA的復制和轉錄，同時內質網蛋白質產生錯誤折疊并產生毒蛋白，葉綠體和線粒體功能失常[8]。與低溫類似的，高溫也是通過信號分子調控轉錄因子，再啟動抗逆功能基因表達。功能基因通過細胞膜、內質網、葉綠體、核酸和代謝等方面的保護作用，使植株產生耐受能力[9]。目前已經發現了TT1、TT2、EF-Tu、GCN5等抗逆基因的分子機制[10]。

高通量測序技術用于大規模分析基因表達并識別基因調控通路[11]。Fowler 等[12]利用基因芯片方法研究了植物低溫應答機制，識別了306 個低溫應答關鍵基因，類似的還有馬鈴薯[13]、番茄[14]等。Zhao等[15]利用測序技術，在高山離子芥測序數據中組裝54 870 個基因，并識別了數千個低溫調控基因。隨后，有關植物低溫應答的轉錄組研究發展迅速，小麥、水稻、香蕉、菠蘿、鐵皮石斛等，促進了低溫應答機制的研究進展[16]。與低溫類似的，高溫脅迫下的轉錄組也是植物學研究熱點。Li 等[17]利用轉錄組，研究了柳枝稷高溫脅迫分子機制，識別了5 365個差異表達基因。王曉曼等[18]報道了棉花、苦瓜、茶樹、牡丹、滸苔、草莓、水稻等亞麻植物相關的高溫脅迫轉錄組研究。

為了研究翅萼石斛花在極端溫度脅迫下的基因表達差異和調控通路，本試驗對翅萼石斛花開展低溫和高溫脅迫轉錄組測序并比較分析，識別翅萼石斛花溫度脅迫應答基因，分析調控通路，為進一步研究翅萼石斛花溫度響應分子機制提供基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料預處理

翅萼石斛由本試驗室提供并鑒定，栽培基質為碎松樹皮+木屑（3∶1），人工氣候室（22 ℃，14 h 光照/d）。處理時將開花的翅萼石斛移入4 ℃和40 ℃進行低溫、高溫脅迫處理，3 h 后取花。以未脅迫作為對照，稱取相同重量，混樣后經液氮冷凍提取總RNA。

1.2 RNA提取與測序

利用RNA 提取試劑盒（Invitrogen）提取樣本總RNA，通過RQ1 DNA 酶（Promega）進行DNA 消化。純化后的mRNAs 在95 ℃裂解后修復末端，連接5'接頭，利用隨機六聚體和帶3'接頭的RT引物進行反轉錄。純化cDNA 被擴增產生150～200 bp 的PCR產物，再進行定量和純化。利用Illumina IIx 基因組分析系統進行32 nt 單端轉錄組測序。得到原始測序數據后，以FASTQ格式文件保存。

1.3 基因組裝與注釋

利用軟件Cutadapt（v1.9.1）去除接頭序列、去除5'或3'末端質量值低于20 或含N 堿基，去除trim 后reads 長度低于75 bp 的序列。合并所有樣本數據后，利用軟件Trinity（v2.2.0）進行從頭組裝，序列聚類后進行序列拼接和冗余去除，得到非冗余長Unigene 序列，統計序列數量與長度分布。利用軟件Trans Decoder（v3.0.0）鑒定ORF 序列，以最長的500 個ORF 序列為訓練集，利用Markov 模型預測。利用BLAST 軟件對Unigene 進行Nr 數據庫、SwissProt 數據庫、GO 數據庫、KEGG 數據庫和COG 數據庫注釋。

1.4 基因表達與調控通路分析

利用FPKM（Fragment Per Kilo Bases per Million Reads）值表示對應Unigene的表達量。使用Bioconductor 軟件包的edgeR（v3.4.6）進行差異表達分析，差異基因表達變化2 倍以上且qvalue≤0.05 定義為差異顯著基因。

2 結果與分析

2.1 測序與注釋

對翅萼石斛花3 個樣本測序，去除低質量數據后，分別獲得37 422 984、27 744 744和28 053 906個Reads（讀長）數據，所有樣本Q20 檢測值均大于97.54%，Q30檢測值均大于93.20%。從頭組裝后，在3 個組織共獲得220 941 條長的、非冗余單基因（Unigene），長度分布在201～16 589 bp，平均長度620.33 bp，GC 含量為40.10%。利用Nr、COG、SwissProt 和KEGG 數據庫分別注釋了91 380、31 193、45 362和8 462條單基因，共94 784條單基因。

2.2 差異表達基因分析

不同溫度對翅萼石斛花誘導基因表達的數量不同。經過計算，與對照相比，翅萼石斛花識別了低溫誘導表達基因451 個，低溫抑制表達基因856 個；高溫誘導表達基因5 411 個，高溫抑制表達基因5 020 個。表明翅萼石斛花在受到極端溫度后均發生了較大程度的基因表達變化，低溫脅迫下調表達基因數量多于上調表達基因，高溫脅迫差異表達基因數量多于低溫脅迫差異表達基因。

2.3 基因調控通路分析

利用GO 聚類分析對顯著差異表達基因進行功能分類，研究具有相同代謝過程或細胞途徑的基因類群。結果表明，翅萼石斛花的低溫應答基因有30個顯著富集功能聚類，分為3 大類：生物過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function），分別有13、6 和11 個功能聚類。相應的，翅萼石斛花的高溫應答基因，分別有11、12 和7 個功能聚類。表1 和表2 分別列出了排名前5 位的類別。由表1、表2 可知，翅萼石斛花在極端溫度脅迫下有大量基因表達，過程涉及膜組成部分、高溫脅迫應答、ATP 結合等多個過程，說明這些生物學過程對于翅萼石斛花溫度應答非常重要。

表1 翅萼石斛花低溫脅迫應答基因的GO聚類分析

表2 翅萼石斛花高溫脅迫應答基因的GO聚類分析

利用KEGG數據庫對差異表達基因進行生物學功能分析，推測參與生化代謝或信號轉導途徑基因的相互協調特征。結果表明，翅萼石斛花的低溫應答基因歸屬通路分為5大類：細胞過程、環境信息過程、遺傳信息過程、代謝和生物系統分別有1、2、4、22和1個通路（表3）。相應的，翅萼石斛花的高溫應答基因歸屬通路分為4大類：細胞過程、環境信息過程、遺傳信息過程和代謝分別有1、1、7和16個通路。

表3 翅萼石斛花低溫脅迫差異表達基因的KEGG分析

KEGG 富集分析結果表明，代謝過程是最主要的富集途徑。在低溫誘導下，代謝和次生代謝途徑包含了很多基因。在高溫誘導下，基因數量明顯高于低溫誘導（表4）。

表4 翅萼石斛花高溫脅迫差異表達基因的KEGG分析

2.4 溫度應答基因表達分析

在數據中查找低溫脅迫有關的應答基因，識別了在脅迫信號感知受體中，鈣離子信號受體的34個鈣調磷酸酶B 類蛋白編碼基因（calcineurin B-like protein，CBL）、118 個絲裂原激活蛋白激酶基因（mitogen-activated protein kinase，MAPK）。CBF 途徑是植物最重要的低溫應答通路，本試驗識別了22個可能 的DREB/CBF（dehydration-responsive elementbinding protein/C-repeat binding factor）基因（表5）。如 DN36819_c0_g1_i1（DREB/CBF 1E）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A 類似亞型X1）和DN86906_c0_g1_i1（DREB/CBF 2C 類似），在翅萼石斛花受低溫脅迫后上調表達，但上調程度較小。DN23757_c0_g2_i1（DREB/CBF 2A 亞型 X1）、DN37118_c0_g4_i1（DREB/CBF 1G）、DN74449_c0_g 2_i2（DREB/CBF 2A 類 似）和DN78101_c0_g1_i1（DREB/CBF 1G），在低溫脅迫后下調表達；DN79705_c0_g1_i3（DREB/CBF 2A 類似亞型X2）和DN9972_c0_g1_i1（DREB/CBF 2E 類似）下調明顯。值得注意的是，DN30330_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A亞型X2）、DN73954_c1_g1_i1（DREB/CBF 2A類似亞型X1）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A類似亞型X1）、DN73954_c1_g1_i4（DREB/CBF 2A 類似亞型X1）、DN79705_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A 類似亞型X2）和DN84346_c0_g1_i1（DREB/CBF 1C 類似），在翅萼石斛花受高溫脅迫后明顯上調表達，說明CBF基因不僅在低溫應答中起作用，而且可能在植物高溫應答中起到重要調控作用（表5）。

表5 翅萼石斛花低溫應答基因舉例

在數據中查找高溫脅迫有關的應答基因，在脅迫信號感知受體中，識別了3個可能的ELF（EARLY FLOWERING）基因，其中DN67438_c0_g1_i3（ELF5亞型X1）在翅萼石斛花受高溫脅迫后明顯下調表達。在高溫脅迫保護基因中，脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，FAD）在高溫脅迫后降解，增加膜的飽和度以適應高溫環境。本試驗識別了21 個可能的FAD 基因。熱激蛋白（heat shock protein，HSP）能復性錯誤折疊蛋白，減少毒性蛋白積累。本試驗識別了82 個可能的HSP 基因，DN65656_c0_g1_i1（16.0 kDaHSP）、DN18591_c0_g1_i1（16.9 kDa 類型1HSP1）和 DN123520_c0_g1_i1（17.0 kDa 類型2HSP）等多個熱激蛋白基因在高溫脅迫后明顯上調表達。

3 討論與結論

在植物受到溫度脅迫后，低溫或高溫引起信號分子響應，通過基因轉錄調控一系列復雜的傳導過程，促使特定抗逆功能基因表達[4，9]。翅萼石斛是具有觀賞價值的藥用植物，溫度脅迫分子調控機制尚不明確。本研究利用低溫和高溫處理翅萼石斛花并進行轉錄組測序，探討溫度脅迫對其主要代謝通路的影響，為揭示低溫和高溫調控抗逆反應的分子機制提供基礎。

由本研究發現，經低溫和高溫處理后，翅萼石斛花中部分基因表達發生了顯著變化。KEGG富集分析結果表明，經低溫誘導的差異表達，基因顯著富集途徑主要包括代謝和次生代謝途徑，而高溫誘導的差異表達基因顯著富集途徑主要包括內質網中的蛋白質加工、RNA 降解、氨酰基tRNA 生物合成、淀粉和蔗糖代謝和甘油酯代謝，涉及的基因更多。具體的分子機制還有待進一步研究。