游泳運動治療對T2DM焦慮樣行為小鼠的影響

張國棟, 鄭爽, 秦雨杭, 劉晟洋, 王郁媛, 謝艷麗*

( 1. 山西農業大學體育部, 太谷 030801; 2. 山西農業大學生命科學學院, 太谷 030801)

糖尿病屬于“富貴病”的一種,其發生因素不僅與生物學因素相關,而且與情緒、飲食和社會環境因素有關[1]。隨著經濟的發展及社會環境的改變,糖尿病目前已經成為嚴重影響人們社會功能和生活質量的疾病,且發病率逐年明顯攀升,并且日益成為一個嚴重的公共衛生問題,被公認為全球性的身心疾病[2-3]。據估計,到2035年,全球二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發病率將上升至5.91億人[3],在過去的幾十年里,臨床研究表明,抑郁、焦慮等情緒障礙與T2DM之間存在流行病學和神經生物學上的關聯。過交感神經影響胰島素的分泌,從而加快機體內糖代謝紊亂,產生抑郁、焦慮的情緒。T2DM發生神經精神疾病的風險更高,幾乎是普通人群的2～3倍,T2DM患者比非糖尿病患者更容易出現抑郁和焦慮[4]。研究表明,T2DM伴隨抑郁和焦慮會增加微血管和大血管并發癥導致的多器官損傷的死亡率[4]。T2DM情緒障礙的病理生理是高度復雜和多因素的,如功能性胰島素抵抗、炎癥、氧化應激、神經遞質系統[5]。焦慮是T2DM最常見的精神共患病和代謝紊亂的一種,涉及持續的恐懼或擔憂,自主亢奮,以及行為障礙等極端的回避和自我安慰行為。影響患者的生活質量和醫療費用增加,導致大腦的結構和功能的缺陷[5]。糖尿病引起的腦功能障礙被認為分別與氧化劑或抗氧化劑標志物,如丙二醛[6]、谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物有關[7]。Mosaferi等[8]研究表明,氧化應激是T2DM和焦慮癥之間的共同機制,大腦中丙二醛和谷胱甘肽降低可導致嚙齒動物焦慮相關行為的增加。毫無疑問,T2DM患者的焦慮相關障礙是需要治療的健康問題。Matinfar等[9]研究定期運動鍛煉可以改善人類和嚙齒類動物的代謝和神經精神疾病,如焦慮、情緒緊張和睡眠等。在合理飲食方案基礎上應用有氧運動的調養,調節和改進機體大腦和神經系統功能狀態,興奮副交感神經系統,調節神經反射,促進體液循環,改善細胞功能,同時增加皮膚溫度,促進周圍毛細血管有效擴張,降低血糖等引起血管功能損傷的危險因素。當T2DM適當運動時,愉悅身心,釋放壓力,從而對患者產生良好的保健功效,調節患者負面情緒,改善生活品質[10]。在不同的神經系統疾病動物模型中,游泳運動被證明可以顯著減少焦慮樣行為和氧化應激的重要手段之一[11]。

因此,為更好地了解T2DM的焦慮行為,并對小鼠采取有氧運動的干預手段,研究T2DM中焦慮和抑郁的確切機制,擬探討游泳運動對T2DM小鼠的焦慮樣行為和腦氧化應激的發生規律、特點、相關因素進行分析,以期為T2MD與有氧運動的康復提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

40只7周雄性C57BL/6小鼠,體重在18～21 g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,許可證號為SCXK(京)2021-0054。小鼠飼養環境溫度為:(22±3)℃,濕度控制在40%～80%,分籠飼養,自由采食和飲水。試驗經北京唯尚立德生物科技有限公司實驗動物倫理委員會批準(倫理規范:VS212600885)。設計路線(圖1)。

w為周;0～3 w使用高脂飼養和鏈脲佐菌素構建T2DM小鼠,3 w后血糖檢測獲得T2DM模型小鼠,隨后分組訓練小鼠,6 w進行血糖波檢測,6～7 w進行曠場和高架十字迷宮檢測小鼠焦慮行為,7 w后收集組織進行病理和血生化檢測

1.2 T2DM小鼠模型制備

動物分為兩組:飼喂正常飼料和高脂飼料3 w。高脂飼料飼養的小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),連續注射3 d(STZ;65 μg/kg;Sigma)。STZ溶解在檸檬酸緩沖液中(0.1 mol/L,pH 在4.2～4.5)。測量空腹血糖以確認高血糖 (空腹血糖≥11.1 mmol/L即為糖尿病)。每周稱重一次,胰島素抵抗穩態模型評估公式為:HOMA-IR=FBG×FI/405,其中,HOMA-IR為胰島素抵抗內穩態指數,FBG為空腹血糖,FI為空腹胰島素。

1.3 游泳試驗

試驗共分為4組:正常對照組(C),正常+鍛煉組(CE),T2DM組(T2),T2DM+鍛煉組(T2E)。游泳鍛煉可參考相關文獻[11]。使用具有控制水溫[(32±1) ℃]的玻璃水箱。非糖尿病和糖尿病動物被分為4個亞組:非運動和運動(每組n=10)。在4周的13:00—16:00每周進行5 d的運動。第一周,小鼠適應小水深(5 cm)10 min。從第2～4周,水深和游泳時間逐漸從5 min增加到15 min,從30 min(第3周,3次10 min)逐漸增加到60 min(從第3周開始;每天6次10 min)。每次鍛煉之間存在10 min的間隔。未鍛煉被放置在空的玻璃水箱中進行相同的時間。

1.4 血糖波動試驗

小鼠游泳鍛煉之后再記錄1 d不同時間節點的血糖。記錄6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00血糖變化。波動差異顯示胰島功能的好壞,動態血糖曲線下面積顯示評估胰島α細胞功能。

1.5 曠場試驗

在最后一次游泳練習后的一天,按照前面所述的進行曠場測試。一個正方形的盒子(40 cm×40 cm×20 cm)被分成16個相等的正方形(10 cm×10 cm)。有12個外方和4個內方塊。在5 min期間測量內方格的時間和條目,作為焦慮樣行為的指標。16個方塊的總記錄也被記錄為運動活動。檢測指標包括:水平運動總距離,進入中央總次數、總進入次數和物體識別辨別指數。物體識別辨別指數用 (discrimination ratio,DR)表示。DR=(N-)/(N+F),其中N為小鼠對新奇物體的探索時間,F為小鼠對熟悉物體的探索時間。DR范圍為[-,1],“-”提示小鼠完全偏向于熟悉物體,而“1”則完全偏向于新奇物體。

1.6 高架十字迷宮試驗

在明暗箱后3 d,動物被暴露于升高的+迷宮中,使用正形器械(離地板高度50 cm),中央區域(5 cm×5 cm),兩個張開(30 cm×5 cm×1 cm)和兩個閉合臂(30 cm×5 cm×15 cm)。在5 min內記錄張開雙臂的時間百分比和風險評估,作為焦慮樣行為的指標。進入開放臂次數(open arm entry,OE):進入任一開放臂的次數,以四肢均進入臂內為準或者以動物身體 80%進入臂內為準。進入閉臂次數(closed arm entry,CE):進入任一閉臂的次數,以四肢均進入臂內為準或者以動物身體 80%進入臂內為準。開臂活動(open arm time,OT):四肢全部進入或者身體 80%進入開臂內的持續時間。閉臂活動(closed arm time,CT):四肢全部進入或者身體 80%進入閉臂內的持續時間。進入開放臂次數百分比公式如下:OE%=OE/(OE+CE)×100%;開放臂停留時間比例公式如下:OT%=OT/(OT+CT)×100%。

1.7 樣本收集

眼眶采血,室溫靜置1 h,在3 000 r/min離心5 min,收集血清至無菌管中,在-80 ℃下保存待測。小鼠經0.9%的冷氯化鈉灌注,取胰腺浸入10%福爾馬林緩沖液,常溫陰涼處保存。收集全腦,-80 ℃保存。

1.8 蘇木精-伊紅(haematoxylin eosin,HE)染色

將福爾馬林包埋的組織逐漸脫水,包埋在石蠟中,切成5 μm切片,脫蠟,最后使用蘇木精-伊紅染色。HE染色切片全景掃描,觀察胰島在光學顯微鏡20倍和40倍下不同組別的病理變化。

1.9 血糖、胰島素、丙二醛、還原性谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫醚檢測

用血糖儀 (ACCU CHEK) 測量空腹血糖,用上海生物工程試劑盒 (Ray Biotech公司) 測定血清中的胰島素。組織樣品在1 mL緩沖液(TBS 0.2% TritonX-100, 2 mmol/L EDTA,PBS與1 mmol/L PMSF)與蛋白酶抑制劑中均質。將勻漿組織離心(15 000 g,4 ℃,15 min)檢測上清液。使用(Sigma)公司試劑盒BCA蛋白檢測上清液中的總蛋白。采用酶聯免疫吸附試驗測定腦勻漿上清液中的丙二醛、還原性谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫醚。試驗步驟按照南京建成生物工程研究院公司試劑盒(丙烯醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫醚)說明書操作。

1.10 統計學分析

使用 SPSS 20.0 軟件包對數據進行統計學處理與分析。所有數據以“平均值±標準方差”表示。各指標組間比較采用單因素方差分析,使用最小顯著性差異法(least significant difference,LSD)檢驗進行兩兩比較,同組實驗前后比較采用配對t檢驗。P<0.05 為差異顯著。同時還進行Tukey的真實顯著性差異(honestly significant different,HSD)檢測。

2 結果分析

2.1 T2DM和游泳運動對體重的影響

從圖2可知,與非T2MD組相比,第3周和第6周T2MD的體重顯著增加。此外,與未運動的T2MD相比,運動在第6周降低T2MD的體重(P<0.01)。兩個非T2DM組之間無顯著差異(P>0.05)。

與正常組相比,**P<0.01;與T2DM組相比,#P<0.05

2.2 血糖波動

為進一步探究游泳運動對T2DM的血糖波動影響,檢測了6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00血糖變化。結果(圖3)顯示血糖在12: 00為一日血糖最高的水平,與T2DM組相比,T2DM+鍛煉組血糖在12: 00和16: 00—20: 00血糖顯著降低,血糖波動相對較小(P<0.05),而正常組血糖波動無差異(P>0.05)。此外,基于血糖波動變化,分析各組的動態血糖曲線下面積,T2DM+鍛煉組血糖血線下面積顯著降低(P<0.05),而正常組血糖波動與游泳鍛煉無差異(P>0.05),如圖3所示。

圖3 血糖波動變化

2.3 游泳運動對T2DM焦慮樣行為的影響

在經過游泳運動之后,T2DM的運動能力和焦慮行為得到改善,如圖4(a)所示。正常組和T2DM組相比,鍛煉顯著提高水平運動的總距離(P<0.01)。另一方面,與正常組相比,T2DM進入中央總次數顯著降低(P<0.01),而運動提高T2DM進入中央總次數(P<0.01),如圖4(b)所示。總進入次數在處理組間未有顯著變化,如圖4(c)所示。分析正常組和T2DM及鍛煉后的物體識別辨別指數,發現正常組在鍛煉之后提高物體識別辨別指數,特別是在T2DM中這種效果更加顯著,如圖4(d)所示。

圖4 T2DM和游泳鍛煉對曠場實驗中焦慮樣行為的影響

2.4 游泳運動對T2DM高架十字迷宮焦慮樣行為的影響

T2DM和運動之間在開放臂上花費的時間顯著相互作用(F0W,5W= 4.15,P<0.05)。T2DM和運動分別對開放臂的時間(F0W,5W= 6.28,P<0.05)、次數(F0W,5W= 16.59,P<0.05)和停留在開放臂時間(F0W,5W= 10.41,P<0.05)有主要影響。此外,運動的主要影響被發現用于高架十字迷宮的風險評估。圖5(a)和圖5(b)顯示,與正常組和T2DM組相比,鍛煉增加進入開放臂次數(P<0.05),但是對進入閉臂次數無顯著變化(P>0.05)。OE%和 OT%:直接反映動物的焦慮水平。焦慮動物的 OE%和 OT%會明顯降低,經典抗焦慮藥物則使兩者升高;圖5(c)和圖5(d)顯示,與正常組和T2DM組相比,鍛煉組進入開放臂次數比例(P<0.05和P<0.01)和停留在開放臂時間(P<0.05和P<0.01)顯著增加。

圖5 T2DM和游泳鍛煉對高架十字試驗中焦慮樣行為的影響

2.5 胰島面積改變

如圖6顯示,正常小鼠胰腺細胞結果完整,細胞核清晰,胰島細胞團為圓形或卵圓形;T2D小鼠胰腺細胞排列松散,胰島細胞壞死明顯。正常小鼠在鍛煉游泳鍛煉之后,胰島細胞并未發生改變,而T2DM小鼠胰島壞死面積較正常組胰島顯著增加,而在鍛煉后,胰島壞死面積均有減小。表明鍛煉可以增強胰島細胞的功能,對胰島抵抗能力得到一定程度的恢復。

圖6 T2DM和游泳鍛煉對小鼠胰島的病理影響

2.6 游泳運動對T2DM葡萄糖、胰島素和胰島素抵抗的內穩態的影響

如圖7所示,與非T2DM組相比,T2DM組顯著增加葡萄糖(P<0.001),胰島素(P<0.001)和胰島素抵抗穩態指數(P<0.001)。與非運動T2DM相比,運動的T2DM還顯示葡萄糖(P<0.001)和胰島素抵抗穩態指數(P<0.001)顯著降低。兩個非T2DM組之間沒有差異。

圖7 T2DM和游泳鍛煉對血糖、胰島素和胰島素抵抗穩態指數的影響

2.7 游泳運動對T2DM大腦中氧化和抗氧化標志物的影響

如圖8所示,與非T2DM組相比,T2DM升高大腦中MDA(P<0.01)和GSSG(P<0.05),降低GSH(P<0.01)水平和GSH/GSSG比值(P<0.01)。與未運動的T2DM相比,運動顯著降低T2DM大腦MDA(P<0.05),增加GSH(P<0.01)。此外,與未運動組相比,正常運動沒有顯著降低GSSG水平(P>0.05)和GSH/GSSG比值。然而,正常對照組與運動T2DM組的大腦GSH/GSSG比值無顯著差異(P>0.05),如圖8(d)所示。在兩組非T2DM組之間沒有觀察到差異。

3 討論

本文研究發現T2DM增加雄性C57BL/6小鼠的焦慮樣行為。對小鼠進行兩項焦慮測試(曠場和高架迷宮),而且糖尿病和游泳運動的影響在所有這些測試中都是相似的。這些測試證實了嚙齒類動物的新奇性誘發焦慮和廣泛性焦慮[12]。嚙齒類動物,如老鼠和大鼠,通常對噪音和白光表現出一種自然的厭惡開放的環境[13]。因此,它們不在測試中心,而傾向于在黑暗區域或靠近設備壁。T2DM和焦慮癥之間的關系已經在人類研究中被報道過。Chaturvedi等[14]研究表明,T2DM患者中普遍焦慮障礙的發生率很高,有很大比例的成人T2DM患者被確定患有焦慮癥,這與缺乏體育活動的有關。此外,在動物研究中,有證據表明T2DM與焦慮相關行為增加有關[15]。與本文研究一致,Kale等[16]證明大鼠的T2DM導致高架十字迷宮的焦慮樣癥狀增加。因此,T2DM是焦慮相關疾病發展的危險因素,但其潛在機制尚有待繼續研究和證實。

游泳運動可以降低T2DM的葡萄糖和胰島素抵抗。得到最近的一項Meta分析[17]的支持,其中運動被證明通過減少T2DM的胰島素抵抗來有效地改善血糖控制。在本文研究中,運動嚙齒動物的胰島素抵抗有顯著改善。此外,這些數據還與體重相關。在C57BL/6小鼠中,誘導T2DM導致體重的增加,而游泳運動則降低T2DM的體重。既往研究表明,氧化應激在焦慮相關疾病的發病機制中起著重要作用,T2DM能夠增加腦中的氧化應激[10]。為解決T2DM對氧化標志物的影響,并考慮到T2DM會對大腦功能產生不利影響,測量動物腦組織中的MDA, GSH和GSSG。研究顯示糖尿病誘導的小鼠在大腦中表現出高水平的MDA和GSSG,而低水平的GSH。發現與非糖尿病動物相比,大腦中的GSH/GSSG比值顯著降低與Matinfar[9]的研究結果吻合。一些研究表明,T2DM顯著增加大鼠大腦中的MDA,降低GSH水平[18]。總而言之,T2DM有可能通過增加小鼠的大腦氧化應激誘發焦慮樣行為。

在這項研究中,觀察到游泳運動有效地減輕T2DM大腦中的焦慮樣行為和氧化應激。彭焱等[19]報道,與沒有焦慮癥狀的人相比,焦慮癥狀較高的T2DM的體力活動較低。現在已經通過各種研究確定,人類和嚙齒動物運動可以減少焦慮相關行為。然而,有研究表明運動對T2DM患者或動物的焦慮癥有益。游泳運動被證明可以減少嚙齒動物的焦慮樣行為。Bashiri等[20]證明游泳運動可以減輕散發性阿爾茨海默病小鼠的焦慮樣行為。研究還表明,壓力和壓力下的焦慮樣行為顯著減少[21]。另一點是不同的鍛煉方案,包括跑步(跑步機或輪子跑步)和游泳運動用于緩解動物模型中的焦慮癥[22],但是游泳運動對于預防/治療焦慮樣行為受到的關注較少。因此,本文研究的結果對于未來T2DM的臨床治療研究具有重要指導和借鑒意義。

本文研究發現游泳運動減少T2DM小鼠腦內的氧化應激標志物(MDA和GSSG)并增加抗氧化因子(GSH)。定期適度的有氧運動似乎可以減輕氧化應激,促進大腦的抗氧化能力[23]。以前的研究[24]表明,游泳運動可以減少大腦中的氧化損傷。這與本文研究結果一致,游泳運動的嚙齒動物顯示較低的氧化標志物,如大腦中的MDA水平。Atasoy等[25]報道,游泳運動對大鼠海馬MDA和GSSG水平的保護作用。在先前的研究中發現,腦氧化應激增加與焦慮樣行為之間的關聯,氧化劑和抗氧化劑狀態正常平衡的紊亂導致腦神經元的損傷[26]。由于行為和生化參數之間存在相關性(數據未顯示),導致焦慮樣行為的結果似乎可能是由于T2DM和運動的小鼠中腦氧化應激的變化有關,這有待進一步研究。

4 結論

本文研究發現,定期的游泳運動可以改善T2DM小鼠胰島細胞的代償功能,減輕胰島抵抗,改善胰島素分泌能力,從而調控血糖水平。這提示:游泳運動對糖尿病患者血糖的恢復和穩定可能是一種不錯的輔助治療方式。糖尿病患者往往具有廣泛的焦慮性,這主要是糖尿病是一種需要終身治療的疾病,不能徹底治愈。如果血糖控制不佳,往往會引起各種并發癥,嚴重甚至會導致糖尿病患者的死亡。本研究顯示游泳運動有效地減輕T2DM小鼠的運動能力和焦慮行為,如水平運動的總距離、物體識別辨別指數、開放臂次數和閉臂次數等,這提示合理的運動能夠改善糖尿病患者焦慮,同樣為游泳運動緩解其他相關疾病帶來的焦慮治療提供一個新的思路。

長期高血糖以及高游離脂肪酸可以通過多種代謝途徑產生大量的自由基,誘導“氧化應激反應”。本文研究顯示,進行游泳運動后,糖尿病小鼠血清中氧化應激標志物MDA和GSSG顯著降低,抗氧化應激標志物GSH顯著增加,表明游泳運動能有效降低機體內的氧化應激水平,抗氧化應激是治療糖尿病并發癥的新策略。