根結線蟲生防細菌物種多樣性及生防潛力研究

劉劍金，莫明和，曹 毅

（1. 云南省煙草公司普洱市公司，云南 思茅 665000；2. 云南大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；3. 貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081）

植物寄生線蟲種類5000 余種，可寄生糧食作物、經濟作物、林木及觀賞植物等3000 多種植物[1]。全世界每年因植物寄生線蟲病害造成的農作物經濟損失達到1570 億美元。其中，以根結線蟲屬（Meloidogyne spp.）對農業生產危害最為嚴重[2]。應用化學殺線蟲劑是控制農作物根結線蟲病害的主要手段，但多數化學殺線蟲劑毒性大、污染環境，應用受到限制[3]。利用線蟲生防微生物研發生物菌劑并應用于線蟲防控是安全、環保的有效措施[7-9]。近年來，利用生防細菌開發的殺線劑已在不同國家登記和應用[4]，但生防菌劑相對較低和不穩定的防效阻礙了其產業化應用。趨化性在線蟲中廣泛存在，其參與線蟲尋找寄主植物和選擇適宜的棲息環境[5]。在土壤中，病原線蟲二齡幼蟲（J2）通過復雜的化感神經元識別來自寄主植物的信號，趨近和侵染根系并建立永久性取食位點[6]。根系生長過程中所營造的低pH 環境及產生的CO2對根結線蟲J2 都具有趨化誘吸作用[7]。根系分泌物的特定組分（丹寧酸、黃酮類、糖苷類、脂肪酸、月桂酸等）可通過調節J2 的趨化性來吸引或趨離線蟲[8]。同樣，線蟲生防菌也可釋放化學信號吸引線蟲自動靠近生防菌。例如殺線蟲芽孢桿菌產生二庚酮等信號分子吸引線蟲靠近生防菌，進而分泌絲氨酸蛋白酶等毒力因子致死線蟲，展現了生防菌誘殺線蟲的精細機制[9]。郝玉娥等系統報道了通過產生揮發性物質吸引線蟲的細菌種類[10]，但目前為止，利用吸引線蟲的生防菌及其趨化底物防控根結線蟲病的研究少有報道。文章首先篩選吸引根結線蟲J2 的生防菌，測定其趨化性，通過盆栽試驗測定吸引線蟲的趨化性細菌在與其趨化底物配合施用時的防效，為這類生防菌的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 生防細菌篩選

從云南大學“西南野生生物種質資源庫微生物庫”獲得分離自各種基質的細菌共1471 株，菌株用LB 培養基活化并用LB 液體培養基在37 ℃下培養48 h。取2 mL 培養液于直徑3.5 cm 的塑料皿中，加入南方根結線蟲J2 懸液（含J2 約200 條）10 μL，以LB 液體培養基替代菌液為對照，每處理3 個重復，室內放置24 h 時鏡檢，計算殺線率，公式如下：

殺線率（%）=（處理J2 死亡數-對照J2 死亡數）/線蟲總數×100。

1.2 生防細菌誘吸活性分析

制備趨化平板：取瓊脂糖15 g 溶解于1 L 無菌水中，滅菌后待冷卻至40 ℃時依次加入5 mL 磷酸鹽緩沖液（K2HPO421.5 g，KH2PO4119 g，定容至1 L，0.22 μm 濾膜過濾除菌）、1M MgSO4溶液1 mL 、1M CaCl2溶液1 mL ，混勻后倒平板。在平板背面用記號筆劃線分割區域，沿著直徑劃線，并在直線兩邊距離邊緣2.0 cm 處分別標記“+”和“-”；以直徑中心為起點，左右各0.5 cm 處作標記點，過這2 個標記點作垂直于直徑到平板邊緣的直線，將整個平板分為A、B、C 3 個區域（圖1）。取J2 懸液10 μL（約200 條）點接于平板的中心點（C 區），在A 區上點接生防細菌的LB 新鮮培養液10 μL，在B 區點接液體培養基10 μL 作為對照，每處理3 個重復；用封口膜將平板密封于28 ℃下避光放置2 h，然后統計各區域的J2 數量。A 區、B 區和C 區的J2 數量分別用A、B、C 表示。生防細菌吸引J2 的能力用趨化指數值（Chemotaxis index，CI）表示：CI=（A-B）/（A+B+C），CI 值越高，表示對線蟲的吸引能力越強；CI＞0 視為吸引；CI≤0視為無吸引活性[11]。

圖1 細菌吸引J2 的平板篩選示意圖

1.3 生防細菌系統發育分析

用細菌DNA 提取試劑盒（Cat#DP2001，BioTeke）按說明書提取細菌基因組DNA。以基因組DNA 為模板，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’） 和 492R （5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增16S rRNA 基因。獲得PCR 產物由北京華大基因生物有限責任公司用ABI PRISM 3730 DNA 自動測序儀測定基因序列。將16S rRNA 基因序列分別在EzBioCloud 數據庫中進行相似性比較，確定菌株的分類地位。

1.4 2 個菌株對尼古丁的趨化測定

尼古丁是煙草根系分泌物的主要成分之一[12]，趨化尼古丁的生防細菌在根際定殖和防效方面具有優勢。P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254對J2 的殺線活性和吸引活性最高；為此，參照文獻描述的滴定試驗法和軟瓊脂平板群集法[12]測定2 個菌株對尼古丁是否具有趨化性，并以不具有趨化性的Alcaligenes faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 菌株為對照。試驗平板中所用的尼古丁終濃度為0.2 mM。

1.5 2 個菌株GFP 標記

按文獻描述的方法制備感受態細胞[13]。向感受態細胞中加入pDSK-GFPuv 質粒0.5 μL，混勻后置于冰上，將待轉化的混合液加入提前置于冰上預冷的1 mm 電轉杯中，選擇適宜的電轉模式后進行電擊，電擊后迅速向電轉杯中加入LB 液體培養基1 mL ，37 ℃，180 rpm 振蕩復蘇3～5 h，取均勻細胞懸液100 μL 涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 平板上，37 ℃倒置過夜培養，挑取陽性轉化子單菌落轉接在LB 液體培養基中，37 ℃、180 rpm 過夜培養，最后取菌液10 μL在熒光顯微鏡40 倍物鏡下觀察是否有熒光并拍照，獲得的陽性轉化子編號分別為P.corrugate YMF 3.02205-gfp 和P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

1.6 趨化性生防細菌防治煙草根結線蟲的盆栽試驗

供試煙草品種為云煙87，3～5 片葉的煙苗從云南省煙草農業科學研究院獲得。盆栽土壤取自云南省峨山縣煙田，土壤在121 ℃下滅菌1 h 后分裝于花盆中（2 kg·盆-1），移栽煙苗，每盆1 株，移栽3 d 時灌根各處理藥劑100 mL·株-1，灌藥2 d 時接種南方根結線蟲J2，1000 條·株-1。處理1：5 億CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌懸液；處理2：5 億CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 菌懸液；處理3：5 億CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌懸液+尼古丁40 μmol·L-1；處理4：5 億CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp+尼古丁40 μmol·L-1；處理5：10%噻唑膦顆粒劑（山東省聯合農藥工業有限公司生產），0.5 g·株-1、混土；處理6（CK）：以等量的LB 液體培養基替代菌液作為空白對照。每處理10 盆，在溫室里隨機排列。移栽60 d 時拔出植株，收集根際土用于測定生防菌生物量，按以下分級標準進行根瘤分級并按公式計算病情指數和防效：2 級：21%～40%的根系有根瘤；3 級：41%～60%的根系有根瘤；4 級：61%～80%的根系有根瘤；5級：81%～100%的根系有根瘤。并按以下公式計算病情指數和防效：病情指數=（n1×1+ n2×2+ n3×3+ n4×4+n5×5）/（S×5）×100，n1-n5分別代表根瘤病級指數；防效（%）=100（1-x/y），x、y 分別代表處理和空白對照的病情指數。

生防菌根際生物量測定：每煙株取根際土1 g 用無菌水梯度稀釋后涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 抗性平板上，3 個重復，37 ℃培養48 h，計數平板上的CFU，以平均每克根際土的菌落數表示生物量。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲生防細菌篩選

由圖2 可知，以南方根結線蟲J2 為靶標，測定了1471 株細菌發酵液對J2 殺線活性，結果顯示99 株細菌對J2 的殺線率≥30%。其中，殺線率在30.00%～39.99%的有46 株，40.00%～49.99%的有27 株，50.00%～59.99%的有10 株，60.00%～69.99%的有12 株，70.00%以上的有4 株。

圖2 在不同殺線率區間南方根結線蟲J2 的菌株數

2.2 根結線蟲生防細菌誘吸活性及種群組成分析

由圖3 可知，在上一實驗中獲得的99 株根結線蟲生防細菌中，58 株對J2 顯示出不同程度的誘吸活性（CI＞0），占58.58%。其中，11 株的CI＞0.2，顯示出較強的活性，占根結線蟲生防細菌總數的18.97%；20 株顯示出中等誘吸活性（0.1＜CI≤0.2），占34.48%；27 株顯示出弱誘吸活性（0＜CI≤0.1），占46.55%；41 株無誘吸活性（CI≤0），占41.41%。

圖3 生防細菌對南方根結線蟲J2 誘吸活性評估（A）及種群組成分析（B）

基于16S rRNA 序列分析，這58 株具有誘吸活性的生防細菌歸屬于放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4 個大類。其中，厚壁菌門種類最多，共30 株，占具有吸引根結線蟲活性菌株總數的51.72%。在厚壁菌門中，芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢屬，共6種16 株菌。變形菌門（Proteobacteria）共有21 株，占總數的36.21%，假單胞菌屬（Pseudomonas）為優勢屬，共4 種10 株菌。放線菌門有4 個屬6 株。在所有菌株中，P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254 對J2 的活性最高（死亡率分別為71.25%和74.63%）、吸引活性也最高（CI 值分別為2.17 和2.46），被選擇用于后續的GFP 標記和盆栽試驗。

2.3 2 個菌株的尼古丁趨化性測定及GPF 標記

如圖4 所示，在滴定測定法中，P.corrugate YMF3.02205（圖4-A2）、P.rhodesiae YMF3.02254（圖4-A3）向平板中央的化合物趨向性運動，在添加的尼古丁附近形成明顯的趨化圈；而對照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趨化圈（圖4-A1）。在軟瓊脂法平板法中，P.corrugate YMF3.02205（圖4-B2）、P.rhodesiae YMF3.02254（圖4-B3）從平板中央的接種點向外趨向性運動而形成明顯的趨化圈；而對照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趨化圈（圖4-B1）。2 種方法的測定結果表明P.corrugate YMF3.02205（圖4-A2）、P.rhodesiae YMF 3.02254 對尼古丁具有趨化性。

圖4 尼古丁趨化性測定

預實驗中P.corrugate YMF3.02205、P.rhodesiae YMF3.02254 在含40 μg·mL-1卡那霉素的抗性平板上不能生長。通過電轉化法將攜帶綠色熒光蛋白基因的重組載體pDSK-GFPuv 導入生防菌株中，通過40 μg·mL-1卡那霉素的單抗平板以及熒光顯微鏡下觀察熒光的雙重驗證（圖5），成功獲得GFP 基因標記的2 株生防菌：P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

圖5 2 個菌株的顯微形態

2.4 2 個菌株對煙草根結線蟲病的防效

表1 顯示了2 株趨化性生防菌對煙草根結線蟲病的防效及其根際定殖能力。從防效上看，P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 對根結線蟲病的防效分別為65.5%和67.3%；添加尼古丁40 μmol·L-1時，2 株生防菌的防效顯著提高，分別為75%和76.9%，但低于化學藥劑噻唑膦的防效85.1% 。 從根際定殖量上看，P.corrugate YMF 3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 在每克根際土中的生物量分別為0.47×103CFU 和0.54×103CFU；添加尼古丁40 μmol·L-1時，2 株生防菌的根際定殖量顯著提高，分別為12.17×103CFU 和10.62×103CFU。

表1 2 個菌株對煙草根結線蟲病的防效及其根際生物量

3 討論

生防菌控制病原線蟲的機制主要包括寄生、捕食、毒殺、拮抗、誘導植物抗性。相對于線蟲在土壤中的快速和遠距離移動，細菌的移動非常緩慢、距離有限。在長期進化中一些土壤細菌會通過產生揮發性有機物吸引線蟲靠近菌體，進而毒殺線蟲而獲得營養[9，14]；因此能吸引線蟲的生防細菌作為生防資源更具有開發和應用價值。然而目前對線蟲具誘吸活性的生防菌資源發掘有限。文章報道了58 株能吸引線蟲的生防細菌，其分類地位分屬多種分類單元，充分體現了這類資源的物種多樣性。生防菌在根際有效定殖并建立相應種群是發揮其生防功能的先決條件。生防菌在土壤中的萌發、生長和定殖嚴重受到“土壤抑生作用（Soil biostasis）”的影響，進而負面影響其防效和穩定性[15]。根結線蟲病為土傳病害，“生防菌-植物根系-靶標線蟲”的互作關系直接影響生物殺線劑的防效；在這三角互作關系中，生物趨化性介導的互作不可或缺。趨化性（chemotaxis）泛指生物（如生防細菌、根結線蟲J2）感受化學效應子信號（如誘吸物、趨避物），調控其運動行為，進而趨近有利環境或趨離不利環境的過程[16]。趨化性生防菌對根系分泌物的趨化對其根際定殖和發揮防效至關重要。植物促生菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在根際定殖時，首先通過趨化系統感受擬南芥根系分泌物而趨近根系，在接觸根系幾小時后才產生生物膜分泌細胞并開始定殖過程[17]。目前，有關趨化性生防菌趨化根系分泌物的機制及對生防菌根際定殖能力和防效的影響認識不足；具有吸引線蟲并趨化根系分泌物的生防菌的生防潛力未見報道。本研究結果表明，既能吸引根結線蟲又能趨化煙草根系分泌物的生防菌Pseudomonas corrugate YMF3.02205 和 P.rhodesiae YMF3.02254 對煙草根結線蟲有良好防效（65.5%和67.3%），特別是生防菌與根系分泌物尼古丁配合使用時能顯著提高其防效和根際定殖力。Ma 等[18]報道了類似的研究結果，發現煙草根系分泌物尼古丁作為趨化底物能提高生防菌Pseudomonas aeruginosa NXHG29 的趨化性、根際定殖力和對煙草黑脛病的防效。韋玉倩等[12]發現，當在菌液中添加40 μmol·L-1尼古丁時，生防菌Brevibacillus brevis Hs8-19，Br.brevis Hs8-13 和P.tremae Ht3-25 對煙草黑脛病的防效分別增加了6.11%、4.79%和4.72%。以上研究充分表明，趨化性生防菌是一類重要的生防資源，是研究生防菌與宿主互作的理想材料，也是開發生防菌劑理想資源，值得加大研發力度，充分發揮這類資源在農業上的應用價值。