乳腺癌腦轉(zhuǎn)移差異基因的生物信息學(xué)分析*

吳雙麗,徐敬宣,邢 龍△

(青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院:1.神經(jīng)內(nèi)科;2.腫瘤內(nèi)科,山東 青島 266500)

腦轉(zhuǎn)移是一個(gè)毀滅性的惡性腫瘤并發(fā)癥,影響約20%的癌癥患者[1]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,近年來隨著新療法的引入,乳腺癌的治療發(fā)生了巨大變化。但是由于患者生存期的延長(zhǎng)及血腦屏障的存在,腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病率持續(xù)上升,這給腫瘤學(xué)專家?guī)砹颂魬?zhàn),同時(shí)也導(dǎo)致患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量顯著下降[2]。從歷史上來看,將患有腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者排除在臨床試驗(yàn)之外,使得治療選擇更加有限。低存活率及較高的致殘率迫使人們尋找新的治療方法,以提高治療成功的概率。近年來,分子靶向藥物在眾多惡性腫瘤的治療中取得了驕人的成績(jī),但分子靶向治療在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中研究尚少,因此研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,進(jìn)而制定有針對(duì)性的治療策略將造福眾多乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者。微陣列技術(shù)已被用于眾多惡性腫瘤的致癌基因研究中,發(fā)現(xiàn)了許多具有重要科研及臨床價(jià)值的核心基因,本研究通過對(duì)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移組織基因芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期發(fā)現(xiàn)具有與患者預(yù)后相關(guān)核心基因。

1 材料與方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)集選取 以“breast cancer”和“brain metastases”為檢索詞在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)上檢索基因芯片數(shù)據(jù)集,從檢索出的數(shù)據(jù)集中選取GSE1259892(平臺(tái):GPL571HG-U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array)進(jìn)行研究,該芯片集中有乳腺癌組織及乳腺癌腦轉(zhuǎn)移組織樣本各16例。

1.2方法

1.2.1篩選差異基因 分別通過在線工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)選出芯片集中乳腺癌腦轉(zhuǎn)移組織與乳腺癌組織的差異表達(dá)基因(DEGs)。篩選條件為|logFC|>2和校正P<0.05。以logFC>2、logFC <-2作為上下調(diào)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2DEGs的KEGG和GO富集分析 通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)篩選得到的DEGs進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,以校正P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO功能富集分析主要包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、和分子功能(MF)。

1.2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 使用在線工具STRING構(gòu)建DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI),并利用CytoHubba 插件進(jìn)一步對(duì)差異基因編碼蛋白相互作用進(jìn)行可視化處理,利用CytoHubba插件篩選度(Degree)位于前10位的為核心基因。

1.2.4核心基因生存分析 將10個(gè)核心基因?qū)朐诰€工具Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/an-alysis/index.php?p=background)選擇OS進(jìn)行生存分析,以P<0.05為條件篩選出與預(yù)后明顯相關(guān)的核心基因。

2 結(jié) 果

2.1篩選差異表達(dá)基因 將芯片結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后,鑒定出GSE125989中共篩選出72個(gè)DEGs,其中上調(diào)基因6個(gè),下調(diào)基因66個(gè)。見表1。

表1 差異表達(dá)基因

2.2差異基因GO及KEGG富集分析 GO功能注釋顯示BP在細(xì)胞外基質(zhì)組織、膠原原纖維組織、細(xì)胞黏附等方面顯著富集;CC主要在胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外的外來體等方面顯著富集;MF主要在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞外基質(zhì)具有抗拉強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)成分、膠原結(jié)合區(qū)等方面顯著富集。見圖1A。KEGG通路主要在蛋白質(zhì)消化吸收、ECM受體的交互作用、癌癥中的蛋白聚糖等方面富集(圖1B)。

圖1 差異基因GO和KEGG富集分析

2.3PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò),并利用CytoHubba 插件以進(jìn)一步對(duì)DEGs編碼蛋白相互作用進(jìn)行可視化處理,上、下調(diào)的基因被標(biāo)記為紅色和綠色(圖2)。利用 CytoHubba 插件以度來篩選 PPI 網(wǎng)絡(luò)中相互作用排名前10 位的 DEGs 作為核心基因。見圖3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖3 核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.4核心基因生存分析 使用在線工具Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行生存分析,得到核心基因與患者總生存期(OS)關(guān)系,其中DCN、ELN與患者OS具有顯著相關(guān)性。見圖4。

圖4 核心基因生存分析

3 討 論

目前,腦轉(zhuǎn)移瘤的確切發(fā)生率尚不清楚,但由于現(xiàn)有治療手段的進(jìn)步使得許多癌癥患者生存期更長(zhǎng)、預(yù)后更好;另外,監(jiān)測(cè)成像技術(shù)的使用、人口老齡化、人群健康意識(shí)提高及腫瘤學(xué)家的認(rèn)識(shí)水平提高,腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生率正在逐步上升,腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率在實(shí)體腫瘤患者中約占30%。此外,尸檢隊(duì)列的數(shù)據(jù)表明,腦轉(zhuǎn)移瘤的真實(shí)發(fā)生率在某些原發(fā)癌患者中較高[3-4]。惡性腫瘤中最易出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移瘤的前3位是肺癌、乳腺癌和黑色素瘤,約占全部腦轉(zhuǎn)移瘤的67%～80%[5]。流行病學(xué)結(jié)果顯示,小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌患者在診斷時(shí)有較高的腦轉(zhuǎn)移率,而黑色素瘤患者則有較高的腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[6]。盡管腦轉(zhuǎn)移在兒童中很少見,但在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、黑色素瘤和生殖細(xì)胞腫瘤患者中都表現(xiàn)出較高的腦轉(zhuǎn)移的傾向[7-8]。

DCN(decorin )一方面可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移,另一方面可抑制腫瘤組織中的血管生成[9]。有研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌組織中DCN表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157細(xì)胞的DCN進(jìn)行過表達(dá)處理,細(xì)胞系的增殖速率可被顯著抑制[10]。HU等[11]研究發(fā)現(xiàn),DCN在炎性乳腺癌患者的腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào),在IBC異種移植小鼠模型中,過表達(dá)DCN可通過破壞E-cadherin的穩(wěn)定性和抑制EGFR/ERK信號(hào)通路減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力。ZHAO等[12]通過將一種基于DCN蛋白研制的溶瘤毒素(rAd.DCN),通過對(duì)免疫活性乳腺腫瘤模型瘤內(nèi)和靜脈給予rAd.DCN,發(fā)現(xiàn)與靜脈輸注相比,瘤內(nèi)注射rAd.DCN可產(chǎn)生更高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá),誘發(fā)更強(qiáng)的腫瘤溶瘤作用,而靜脈輸注可導(dǎo)致肺部病毒積聚量增加,可起到防止腫瘤肺轉(zhuǎn)移的作用,肺組織中DCN的表達(dá)增加了Th1細(xì)胞因子的表達(dá),如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-12和腫瘤壞死因子α,降低了Th2細(xì)胞因子的表達(dá),如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和IL-6。此外,rAd.DCN治療可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的全身炎癥反應(yīng)和上調(diào)CD8+T淋巴細(xì)胞,提示rAd.DCN在抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)可抑制肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。另外,還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在三陰性乳腺癌小鼠模型中,在高劑量照射下腫瘤周圍肌肉比常規(guī)照射下分泌更多的DCN,提示腫瘤周圍肌肉分泌的DCN可能是超分割放療能更有效抑制TNBC生長(zhǎng)的原因之一[13]。此外,DCN表達(dá)上調(diào)可減弱三陰性乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。

ELN編碼的蛋白為彈性蛋白,是彈性纖維的主要成分。在許多惡性腫瘤中,重建的ECM表達(dá)高水平的彈性蛋白,這可能對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有積極或消極的影響。彈性蛋白與其他ECM組分的交聯(lián)以及控制這一過程的酶都對(duì)腫瘤的發(fā)生有影響。彈性蛋白酶的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶,是腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[14]。LI等[15]研究發(fā)現(xiàn),彈性蛋白是結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素,通過對(duì)2個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集中分析ELN基因在結(jié)直腸患者腫瘤組織、鄰近非腫瘤結(jié)腸組織及健康對(duì)照組中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與癌旁非腫瘤組織和健康對(duì)照組相比,結(jié)直腸癌患者腫瘤中ELN基因表達(dá)增加,提示ELN在結(jié)直腸腫瘤發(fā)展和微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。亦有學(xué)者研究結(jié)果提示,ELN的表達(dá)與膀胱癌[16]、膠質(zhì)瘤[17]患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述,通過對(duì)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移組織與乳腺癌組織之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)DCN、ELN 2個(gè)與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后相關(guān)的核心基因,由于腫瘤位置特殊性,能選用的數(shù)據(jù)集及樣本量雖較少,但仍可為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的預(yù)后和治療提供一定方向。