養(yǎng)血補(bǔ)腎方對形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜重塑及TGF-β2的作用研究

羅悅，郭曉勤，陳亦霞，曹雯媗，亢澤峰，莊曾淵，楊劍英，吳寧玲

近視是屈光不正的一種形式，表現(xiàn)為視遠(yuǎn)模糊、屈光度超過-0.50 D、軸向長度增加等[1]。如今，近視正影響著全球約25 億人的視覺質(zhì)量[2]。研究[3]認(rèn)為，鞏膜重塑是高度近視的根本原因之一，而轉(zhuǎn)化生長因子-β2（transforming growth factor-β，TGFβ2）是鞏膜重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用養(yǎng)血補(bǔ)腎方（YangxueBushenFormula，YXBS）可以改善高度近視視網(wǎng)膜的血供，延緩高度近視發(fā)展。本研究以形覺剝奪性近視（form-deprived myopia，F(xiàn)DM）豚鼠模型為研究對象，觀察YXBS 對FDM 豚鼠鞏膜膠原及TGF-β2 表達(dá)的影響，初步探討YXBS 治療近視、影響鞏膜重塑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

2 周齡雄性普通級健康三色豚鼠40 只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心[許可證號：SCXK（京）2022-0004]，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院眼功能實(shí)驗室，自由進(jìn)食，室溫20～22 ℃，晝夜循環(huán)照明，定期檢查豚鼠眼部健康狀況。本研究實(shí)驗動物及實(shí)驗所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實(shí)驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥品、試劑與儀器

1%復(fù)方托吡卡胺滴眼液、0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥有限公司，J20210051、H20210362），鼠抗TGF-β2抗體（上海惠誠生物科技有限公司，GMP-042），磷酸鹽緩沖液（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，SS1657）。眼科A/B型超聲診斷儀（天津市索維電子科技有限公司，RU-1020CG），偏光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，BX51-P），帶狀檢影鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，YZ24），自動脫水機(jī)、鋪片機(jī)、烤片機(jī)、切片機(jī)（德國Leica 公司，LEICA 300、LEICA 255、HI1220、RM2255）。

YXBS 的組成：枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、車前子、熟地黃各15 g，白芍、當(dāng)歸、川芎、丹參、白術(shù)各12 g，黃芪20 g，均由中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院中藥房提供，加水煎煮并濃縮成濃度為1 g/mL 的藥液使用。

1.3 建立FDM豚鼠模型

正常飼養(yǎng)7 d后，選取40只豚鼠以塑料眼罩（乳白色半透明氣球）遮蓋右眼，以右眼作為模型眼；左眼不做特殊處理，為自身對照眼，建立FDM 豚鼠模型[5]。遮蓋右眼、正常飼養(yǎng)60 d 后，行雙眼檢影驗光、眼軸測量，以造模前后雙眼屈光度和眼軸差異有統(tǒng)計學(xué)意義，視為造模成功。

1.4 分組與給藥

將上述造模成功的40 只FDM 模型豚鼠隨機(jī)分為YXBS 組和模型組（model group，MG），每組各20 只。YXBS 組豚鼠給予12.70 g/kg YXBS 灌胃，MG組給予灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，每日1 次，連續(xù)15 d。

1.5 屈光度與眼軸檢查

（1）屈光度：于造模前1 d 和造模后第60 天，將豚鼠置于暗室，1%復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，帶狀檢影鏡檢影驗光，雙眼各1 次。散光以半量等效球鏡度計算屈光度。（2）眼軸：于造模前1 d 和造模后第60 天，在豚鼠雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，在室內(nèi)自然光環(huán)境，調(diào)整A超增益矯正儀器，應(yīng)用A/B 超檢測豚鼠眼軸，雙眼各1 次，每次連續(xù)測量3次，取平均值。

1.6 HE染色觀察鞏膜形態(tài)

灌胃結(jié)束后1 d 后取材。豚鼠麻醉處死后，采用75%乙醇對雙眼眼瞼及周圍消毒，標(biāo)記與角膜中央水平徑線處垂直的鼻側(cè)、顳側(cè)角膜緣，沿記號剪開球結(jié)膜，摘除豚鼠眼球，置于視野操作臺的玻璃皿中。于顯微鏡下用眼科顯微剪剪開角鞏膜緣，依次去除眼前節(jié)組織、玻璃體，保留鞏膜組織，放入4%多聚甲醛中固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片，并行蘇木精—伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE），于顯微鏡下觀察鞏膜組織形態(tài)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測鞏膜TGF-β2表達(dá)

將上述制備的切片經(jīng)浸蠟、脫蠟、洗蠟、抗原修復(fù)、封閉后，加鼠抗TGF-β2 抗體（稀釋比例1∶200）孵育過夜。次日洗片后，加入二抗孵育1 h，依次進(jìn)行顯色、復(fù)染、中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并采用“北航圖像分析系統(tǒng)”測量陽性區(qū)灰度值，圖片采集均從視神經(jīng)切面旁開一個視野開始，在高倍鏡視野下以400 倍拍攝2～3 個圖像，陽性區(qū)灰度值越大，則TGF-β2表達(dá)水平越高。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MG組FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化

（1）屈光度：造模前MG 組豚鼠雙眼屈光度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模前對照眼屈光度較造模后，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與造模前比較，造模后模型眼屈光度降低（t=15.960，P=0.000），且低于造模后對照眼（t=14.962，P=0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）眼軸：造模前MG 組豚鼠雙眼眼軸比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模后雙眼眼軸均較造模前延長（t模型眼=21.274，t對照眼=15.844，均P=0.000），且模型眼眼軸長于對照眼（t=5.998，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化（±s，n=20）

表1 FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化（±s，n=20）

注：* 與對照眼比較，P＜0.05；# 與造模前比較，P＜0.05；FDM形覺剝奪性近視

眼別模型眼對照眼t值P值屈光度（D）造模前3.52±0.79 3.57±0.72 0.296 0.384造模后-2.88±1.61*#3.12±0.79 0.296 0.384眼軸（mm）造模前7.32±0.18 7.35±0.16 0.557 0.581造模后8.60±0.20*#8.23±0.19#5.998 0.000

2.2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜形態(tài)的影響

MG 組豚鼠對照眼鞏膜膠原呈緊密排列狀態(tài)，纖維間隙小，纖維束間均勻分布著膠原細(xì)胞，膠原細(xì)胞胞核數(shù)量較多，纖維分布有序，走行規(guī)則、結(jié)構(gòu)較均一；MG 組豚鼠模型眼鞏膜厚度明顯縮小，纖維直徑縮小，鞏膜膠原稀疏，走行欠規(guī)則，纖維間隙擴(kuò)大；YXBS 組模型眼鞏膜膠原排列較為緊密，纖維束間均勻分布著膠原細(xì)胞，膠原細(xì)胞胞核數(shù)量較多，纖維走行稍欠規(guī)則，纖維間隙稍縮短（圖1）。

圖1 YXBS對FDM豚鼠鞏膜形態(tài)的影響（HE染色，×400）

2.4 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達(dá)的影響

TGF-β2 陽性染色主要集中在光感受器細(xì)胞層，在MG 組模型眼中明顯減弱，在MG 組對照眼、YXBS組模型眼中染色較強(qiáng)（圖2）。2組豚鼠對照眼的TGF-β2 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照眼比較，2 組豚鼠模型眼鞏膜TGF-β2表達(dá)水平均降低（tYXBS=4.538，tMG=6.981，均P=0.000），且YXBS 組豚鼠模型眼TGF-β2 表達(dá)水平高于MG 組模型眼（t=2.154，P=0.049），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

圖2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×400）

表2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達(dá)的影響（±s，n=8）

表2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達(dá)的影響（±s，n=8）

注：* 與對照眼比較，P＜0.05；# 與MG組比較，P＜0.05；FDM 形覺剝奪性近視；TGF-β2 轉(zhuǎn)化生長因子-β2

組別YXBS組MG組t值P值TGF-β2模型眼109.04±12.12*#95.82±12.43*2.154 0.049對照眼132.20±7.84 133.24±8.68 0.252 0.805

3 討論

研究[6]表明，眼球后極部鞏膜異常擴(kuò)展、變薄伴鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度降解是高度近視不斷發(fā)展的關(guān)鍵病因之一。實(shí)驗研究[7]顯示，眼軸延長與鞏膜重塑直接相關(guān)，而鞏膜重塑取決于鞏膜ECM 構(gòu)成的改變。鞏膜ECM 由鞏膜成纖維細(xì)胞合成，膠原是其主要組成成分，鞏膜膠原蛋白的積累與分解，直接影響鞏膜的生物力學(xué)，引起眼軸變化[8]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)DM 豚鼠模型眼的平均屈光度、眼軸，在形覺剝奪60 d 后降低，提示單眼FDM豚鼠模型成功建立。

TGF-β2 被認(rèn)為是鞏膜重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，高度近視患者鞏膜TGF-β2 的表達(dá)水平與眼軸長度具有相關(guān)性。TGF-β2 表達(dá)的顯著下調(diào)，可使成纖維細(xì)胞的增生活性降低，ECM 合成分泌減少，纖維鞏膜變薄，鞏膜抵抗力降低，鞏膜易于延伸，從而導(dǎo)致眼軸延長[11]。有研究[12]認(rèn)為，TGF-β受Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路調(diào)控，介導(dǎo)鞏膜重塑。在FDM豚鼠的眼睛中，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路被激活[13]，TGF-β2 作為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的下游因子，可促進(jìn)ECM 中I 型膠原蛋白的降解，使鞏膜膠原蛋白的積累減少，引起鞏膜重塑[7]；TGF-β2 還參與了信號的跨膜傳遞，由跨膜I 型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞與ECM 之間的內(nèi)部和外部通訊[14]，調(diào)節(jié)鞏膜重塑。因此，通過調(diào)節(jié)TGF-β2 調(diào)控鞏膜重塑可能是治療近視的有效途徑。

本研究結(jié)果顯示，MG 組模型眼鞏膜TGF-β2的表達(dá)低于對照眼，YXBS組模型眼鞏膜TGF-β2的表達(dá)高于MG 組模型眼。由此可見，F(xiàn)DM 模型的建立下調(diào)了豚鼠鞏膜TGF-β2表達(dá)，而YXBS可上調(diào)鞏膜TGF-β2的表達(dá)。

有研究[15]認(rèn)為，肝腎虧虛、氣血不足是近視進(jìn)展的基本病機(jī)，并總結(jié)出莊曾淵教授的經(jīng)驗方—養(yǎng)血補(bǔ)腎方。本方根據(jù)肝腎虧虛、氣血不足的基本病機(jī)，由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、丹參、黃芪、白術(shù)組成，臨床療效良好。方中枸杞子補(bǔ)肝腎、益精明目，菟絲子補(bǔ)益肝腎明目，覆盆子益腎、養(yǎng)肝明目，車前子明目，五味子補(bǔ)腎益氣生津，此五藥重在補(bǔ)益肝腎明目；熟地黃補(bǔ)血滋陰，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，白芍養(yǎng)血柔肝，川芎活血行氣，丹參活血祛瘀，此四藥重在養(yǎng)血活血；黃芪補(bǔ)氣升氣，白術(shù)健脾益氣。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎明目、益氣活血之功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[16]表明，YXBS中多種中藥與近視鞏膜重塑有關(guān)。黃芪的主要成分黃芪多糖在腫瘤、糖尿病等多種疾病中促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖及I型膠原的合成。在近視動物模型中，有研究[17]發(fā)現(xiàn)黃芪、當(dāng)歸、丹參、五味子等中藥組成的含藥血清，能影響鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖，從而參與鞏膜ECM 的合成與降解。此外，由枸杞子、菟絲子、五味子、車前子、丹參等組成的補(bǔ)精益視片，可上調(diào)近視眼中透明質(zhì)酸的表達(dá)并下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白c-jun的表達(dá)，參與鞏膜重塑，達(dá)到干預(yù)近視的效果[18]。還有研究[19]證實(shí)，在高度近視人眼鞏膜中，膠原纖維束明顯變細(xì)，單個膠原原纖維的直徑減小，這與本課題組前期研究結(jié)果一致，而YXBS 能有效延緩后鞏膜延伸，阻止近視進(jìn)展[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測YXBS 可能通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，上調(diào)FDM 豚鼠鞏膜組織TGF-β2 的表達(dá)，使成纖維細(xì)胞的增生活性升高，影響鞏膜ECM 膠原蛋白的合成及降解，調(diào)節(jié)鞏膜重塑，進(jìn)而抑制纖維鞏膜變薄，提高鞏膜抵抗力，有效抑制近視進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YXBS 可通過上調(diào)FDM豚鼠鞏膜組織中TGF-β2 的表達(dá)，調(diào)節(jié)鞏膜重塑，延緩鞏膜變薄，控制近視發(fā)展。本研究可為臨床養(yǎng)血補(bǔ)腎方的應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。