龍膽瀉肝湯治療葡萄膜炎作用機制的研究進展

李嚴為，樊倩，歐陽東，孫莉，王虹霞

葡萄膜炎（uveitis，UV）是以眼部炎癥為特征的疾病的集合[1]。UV的發病機制復雜，感染、自身免疫性疾病、機械損傷均可能引起UV，其更多被認為是免疫介導的，具有免疫系統相關性[2]。UV是導致視力喪失的主要原因之一，易并發其他眼科疾病，包括青光眼、黃斑水腫和白內障等[3]。其中，前葡萄膜炎（anterior uveitis，AU）是UV 中最常見的類型，約占患者總數的50%[4]。臨床上針對UV 目前尚無特效藥物，糖皮質激素（glucocorticosteroid，GCS）是治療UV 的主要手段，GCS 確實能夠有效控制UV 的眼部炎癥，但在治療過程中帶來的諸多副作用與其本身的諸多禁忌證卻有較大弊端。近年來的研究[5-6]表明，中西醫結合治療能明顯提高UV 的療效。UV 屬中醫學“瞳神緊小”“瞳神干缺”“視瞻昏渺”“云霧移睛”等病范疇，病因病機與肝、膽最為相關，而龍膽瀉肝湯（LongdanXieganDecoction，LDXG）是清利肝膽濕熱的名方。近年來，LDXG 及其加減方在UV 的臨床研究中有著較高的使用率，基礎研究也發現單純應用LDXG 可明顯緩解UV 動物或細胞模型的病理損傷，減輕炎癥反應。為了能更好地指導臨床應用，本文對LDXG 治療UV 的藥理機制進行綜述，現報道如下。

1 LDXG的組方及方解

LDXG出自清代醫家汪昂編寫的《醫方集解》[7]，是臨床應用較廣且具有代表性的方劑之一[8]，全方由龍膽草、黃芩、梔子、澤瀉、木通、車前子、當歸、生地黃、柴胡和生甘草共10 味中藥組成[9]，以龍膽草為君藥，其有清熱燥濕、瀉肝膽火之功；黃芩、梔子共助清瀉肝火之力，梔子、澤瀉、木通、車前子可清利下焦濕熱，“使肝膽火從小便出”，澤瀉、木通、車前子又同時有“清心、分清泌濁”之功，五者共為臣藥；肝膽實火“易耗傷陰液”，生地黃、當歸養血柔肝，以防苦寒傷肝[10]，其中生地黃涼血亦養陰，當歸活血養血，使全方涼而不凝，二者共為佐藥；柴胡疏理氣機，以防全方一派苦寒之品郁閉肝經之調達，生甘草調和眾藥，二者共為使藥。全方具有清瀉肝膽實火、清利肝經濕熱的功效，主要治療肝膽實火上炎及肝經濕熱下注所致的臨床諸癥[11]。

2 LDXG干預UV的藥效學研究

2.1 增強機體及局部抗氧化能力

氧化應激在UV 的發病過程中發揮重要作用，氧化應激介導的光感受器細胞損傷是自身免疫性UV 的早期病理改變，調節或控制氧化應激有助于改善UV 的癥狀[12]。白蛋白是機體最重要的內源性抗氧化劑之一[13]，UV 的發病與白蛋白的下降具有關聯性[14]。唐凱等[15]發現，實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）大鼠在免疫后第4、8、12天的房水白蛋白水平均低于對照組，而LDXG干預的EAU 大鼠白蛋白在第12 天恢復至正常水平，提示LDXG 能夠有效提升房水白蛋白濃度，減輕纖維蛋白滲出，對血-房水屏障有一定保護作用，從而減少氧化應激損傷。

2.2 調節機體及眼部免疫

田慶梅等[16]發現，使用LDXG 治療且已治愈的肝膽火熾型AU 患者外周血的干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）和白細胞介素-17（interleukin 17，IL-17）水平降低，白細胞介素-10（interleukin 10，IL-10）水平升高。向圣錦等[17]發現，在UV 的治療中LDXG 能夠抑制促炎因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF- α）、白細胞介素-23（interleukin 23，IL-23）、IFN-γ、IL-17 等的表達，而增加抗炎因子IL-10 的表達，提示LDXG 能在一定程度上維持促炎因子和抗炎因子的相對穩態平衡，進而調節UV 的眼部免疫炎癥反應。球蛋白是由淋巴細胞產生的一種血清蛋白，具有重要的免疫調節作用，UV發病時機體屬于免疫亢進狀態，球蛋白水平升高。動物實驗研究[15]顯示，LDXG 能干預球蛋白水平使之趨于穩定狀態，表明LDXG 能夠降低機體對自身抗原的免疫應答。LDXG 還可升高T細胞CD4+比例、降低CD8+比例，提高細胞免疫和體液免疫的作用[18]。還有研究[18-19]發現，LDXG 可升高實驗動物的血清溶菌酶、溶血素抗體水平和T細胞轉化率，對免疫功能有明顯促進作用。

2.3 鎮痛和抗炎作用

LDXG 能夠改善AU 患者眼部疼痛癥狀，但其作用機制尚不明確[20]。蒲維婭[21]發現，LDXG 可減少疼痛模型小鼠的扭體次數，延長痛閾值，具有顯著的鎮痛作用。此外，LDXG對多種炎癥過程均有顯著抑制作用，如肝膽濕熱型分泌性中耳炎的炎性滲出、毛細血管通透性升高、炎性介質釋放等[22]。

3 LDXG干預UV的分子生物學研究

3.1 Notch信號通路

3.1.1 CD4+T 淋巴細胞與Th17/Treg 細胞 LDXG 可調控CD4+T 淋巴細胞向輔助性T 細胞（T helper cell，Th）17 或調節性T 細胞（regulatory cell，Treg）分化，改善UV 病程中的Th17/Treg細胞比例失衡，從而有助于機體的免疫功能恢復。白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）與轉化生長因子- β（transforming growth factor β，TGF-β）是決定CD4+T淋巴細胞向Th17 或Treg 細胞分化的關鍵細胞因子[23]，有研究[24]報道，Treg 細胞數量減少或功能紊亂、Th17/Treg 細胞失衡均可導致EAU 的發生。還有研究[25]證實，Th17/Treg 細胞比例失衡與EAU 病程發展密切相關。Notch 信號通路是維持機體免疫平衡的重要信號通路，其信號分子可調控CD4+T淋巴細胞向Th17/Treg 細胞分化。劉濱等[26]發現，EAU 大鼠造模12 d后Th17/Treg 細胞比例失衡，脾和淋巴結中的Notch1、Notch2和Notch4 表達異常增高。殷學偉等[27]發現，經LDXG 干預的EAU 大鼠的脾臟、淋巴結、眼組織中Notch1蛋白、δ樣蛋白-4表達均低于對照組，而LDXG 可抑制Notch 通路活化，減輕Th17/Treg 細胞比例失衡，調節免疫狀態和促進免疫修復，有效維持眼局部免疫平衡，從而對UV起到干預作用。

3.1.2 RBPJ基因與Th1/Th2細胞 Th1/Th2比例及相關細胞因子表達失衡與UV 的發生發展密切相關[28]。在UV 發生發展過程中，Th1、Th2 是一組起截然相反作用的細胞，前者對疾病起加速促進作用，后者則為抗炎表達[29]。Th1 細胞以分泌IFN-γ 為主要特征，主要負責細胞免疫、誘導遲發型超敏反應，而Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-13，其中IL-4 分泌最具有代表性，主要參與免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1，IgG1）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）抗體產生。IFN-γ 和IL-4 可以分別代表Th1 和Th2細胞應答的水平[30-31]。人重組無毛結合蛋白抑制因子（recombining binding protein suppressor of hairless，RBPJ）是一種轉錄因子，在細胞核內發揮重要作用，參與Notch 信號通路的調控[32]。在UV 的發展過程中，Notch信號通路的活化在Th1 和Th2 細胞分化過程中起重要作用，這和UV 的發病進程密切相關。周夢賢等[33]發現，使用LDXG 干預的EAU 大鼠機體及眼組織中RBPJ及蛋白表達水平均降低，Th1/Th2細胞比例逐漸恢復均衡，提示LDXG 可下調轉錄因子RBPJ 的表達來抑制Notch 信號通路的活化，降低Th1 細胞以及IFNγ 表達水平，提高Th2 細胞以及IL-4 表達水平，改善Th1/Th2細胞比例，達到治療UV的目的。

3.2 M1/M2巨噬細胞

巨噬細胞是一種重要的抗原提呈細胞，在IFN-γ、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等炎癥因子刺激作用下，巨噬細胞可極化為促進疾病進展的M1 型巨噬細胞；而在Th2 細胞因子作用下，巨噬細胞可極化為促進組織修復的M2 型巨噬細胞[34]。M1 型巨噬細胞分泌多種促炎因子，如白細胞分化抗原86（cluster of differentiation 86，CD86）、TNF-α、一氧化氮合成酶（innovation neighborship originality and satisfaction，iNOS）等；M2 型巨噬細胞則分泌抗炎因子，如精氨酸酶1（arginase1，Arg1）及IL-10 等[35]，2 種標志物是競爭性酶的關系，共同調控巨噬細胞的整體功能。M1/M2型巨噬細胞極化失衡可影響自身免疫性疾病如UV 的發展[36-37]。殷學偉等[38]發現，相比對照組大鼠，EAU 大鼠機體與眼組織內iNOS的表達升高，Arg1 表達降低，M1/M2 型巨噬細胞比例不均衡；而LDXG 干預組大鼠血清及眼組織中iNOS 表達降低，Arg1 表達升高，M1型極化比例下降，M2型極化比例升高，其比值逐漸均衡，提示LDXG 對UV 的治療作用可能與其對M1/M2 型巨噬細胞極化的調控有關。

3.3 補體C4與MBL2表達

UV 的發病與眼部免疫功能失調、補體系統紊亂有關[39]。補體C4 可調節T 細胞的免疫應答作用，血清中補體C4 表達較高會加速UV 的發生發展，反之則有積極的抵御作用[40]。ZHANG L 等[41]發現，敲除C4 基因的EAU 小鼠視網膜炎癥嚴重程度低于野生型小鼠。甘露糖結合凝集素（mannosebinding lectin，MBL）是聚集蛋白家族的成員之一，也是免疫系統的組成部分，其作為信息傳遞分子，參與調控細胞分化、增殖、凋亡等多種細胞生物學過程，如補體激活等[42]，低水平的MBL 與感染性或自身免疫性疾病具有相關性。有研究[43]發現，血清中MBL 表達較低的患者易形成治療抵抗，且類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者低水平的MBL 又與放射性關節損傷相關，提示高血清含量的MBL 或許是免疫性疾病的保護因素。魏慧霞等[44]發現，LDXG 能降低血清補體C4 表達水平，提高血清MBL2 表達水平，調節全身補體系統，從而促進機體及眼組織免疫功能的修復，加速UV 眼部炎癥的消退。

綜上所述，目前研究發現的LDXG 治療UV 的信號通路有以下3 條：（1）LDXG 通過抑制Notch 通路活性，改善UV 病程中的Th17/Treg細胞比例失衡；（2）LDXG可下調RBPJ轉錄因子，抑制Notch 通路活性，降低Th1細胞以及IFN-γ 表達水平，提高Th2 細胞以及IL-4 表達水平，改善Th1/Th2 細胞比例；（3）LDXG 可調控M1/M2 型巨噬細胞的極化，下調促炎因子iNOS，上調抗炎因子Arg1，使M1/M2 型巨噬細胞比例平衡（圖1）。

圖1 LDXG治療UV的信號通路

4 小結

近年來，在我國臨床醫生和研究人員的努力下，中西醫結合治療UV 得到了廣泛應用，中醫藥已然成為UV 治療中重要的部分。在臨床的實際工作中，醫生更期望UV 患者的眼部癥狀加以控制，并降低其復發率和藥物副作用[45]。隨著眼免疫學與UV研究的不斷發展，UV的研究熱點也在發生變化，由原來的如何控制UV 發病逐步轉向探究UV 的發病根源，以及患者預后生活質量。LDXG 具有清瀉肝膽實火、清利肝經濕熱的功效，臨床被廣泛應用于肝膽火熾型瞳神緊小。針對UV 主要病理變化，LDXG 或能通過多種途徑治療UV，其中以免疫調節作用最為顯著。其不僅能夠減輕UV 患者眼局部炎癥，同時還可改善機體免疫功能，縮短病程，降低復發率。但UV 目前缺少一套完整的指南共識，臨床醫師進行辨證論治和遣方用藥的方法不盡相同，不利于開展多中心、大規模的臨床研究及推廣。在此背景下，未來學者還需對LDXG 治療UV 建立更加完善的研究體系，并挖掘探索出更多類似LDXG 的中藥復方的潛力，推進中醫藥現代化發展。