右美托咪定預處理通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對心肌缺血再灌注大鼠心臟損傷和心肌組織自噬的影響

王伊凡,李思遠,張 姣

(1.西安交通大學第二附屬醫院麻醉科,陜西 西安 710004;2.咸陽市第一人民醫院麻醉科,陜西 咸陽 712099;3.西安國際醫學中心醫院麻醉與舒適化醫療中心,陜西 西安 710100;4.咸陽市中心醫院麻醉科,陜西 咸陽 712099)

心肌缺血是一種病理生理狀態,由冠狀動脈狹窄、心肌供血供氧不足引起,可能導致心肌梗死,致使心肌代謝出現障礙和不可逆損傷,因此,盡快恢復心肌缺血區域的血液供應是臨床常見的治療手段[1]。但再灌注恢復血流供應時,產生大量氧自由基,造成組織細胞損傷、壞死或凋亡,因而如何避免再灌注損傷成為治療的關鍵[2]。有研究發現,心肌缺血再灌注損傷的發生與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡及自噬等相關,其中細胞過度自噬可導致心肌細胞凋亡,是造成心肌損傷的主要原因,或可成為臨床治療的新靶點[3]。右美托咪定作為α2受體激動劑,能夠清除氧自由基、調節細胞凋亡等,起到抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用,從而保護器官組織,減輕缺血再灌注損傷[4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路參與細胞增殖與凋亡自噬的調控過程,Akt磷酸化激活后可上調下游信號分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達,進而抑制細胞凋亡、促進細胞增殖,但目前關于右美托咪定與PI3K/Akt/mTOR信號通路之間的作用機制尚不清楚[5]。因此,本研究重點探討右美托咪定預處理通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對心肌缺血再灌注大鼠心臟損傷和心肌組織自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取60只雄性SD大鼠,8周齡,體質量200～240 g,室溫保持在25 ℃上下、相對濕度40%～70%,提供飼料和飲水,由專業人員負責飼養。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥方法:適應性飼養7 d后隨機分為假手術組(n=20)、心肌缺血再灌注組(n=20)、右美托咪定預處理組(n=20),建立心肌缺血再灌注損傷模型。大鼠術前12 h禁食不禁水,經腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg實施麻醉,成功后將大鼠以俯臥位固定在操作臺上,連接動物心電圖儀(秦皇島市康泰醫學系統有限公司,TLC 9803型),監測手術期間大鼠的心電圖變化,氣管插管后連接小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司,ALC-V8型),潮氣量6～8 ml/kg,通氣頻率60～80次/min,呼吸比1∶2。分離右側頸總動脈,將聚乙烯導管經右側頸總動脈緩慢插入左心室,于左側第3肋間剪斷肋間肌,暴露心臟,于左心耳下緣2 mm處,用6-0縫線進針穿過冠狀動脈左降支下方的心肌表層,留置硅膠管后結扎,傷口處覆蓋濕紗布。心肌缺血成功的標準:左心室前壁及心尖周圍心肌組織顏色發紺,心電圖ST段抬高超過0.2 mV。持續缺血30 min后松開結扎線,恢復冠狀動脈血流。再灌注成功的標準:缺血區域局部顏色變紅,心電圖ST段恢復正常。

假手術組僅接受假手術,開胸腔暴露心臟后穿針留線而不結扎,不造成心肌缺血。右美托咪定預處理組經頸靜脈輸注鹽酸右美托咪定注射液(國藥準字H20213633,規格:2 ml∶0.2 mg),先以1 μg/(kg·h)速度持續泵注10 min,再以0.5 μg/(kg·h)速度繼續泵注15 min。假手術組、心肌缺血再灌注組予以等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 儀器與試劑:實時熒光定量PCR儀:賽默飛世爾科技公司,型號:PikoReal 96。由上海生物技術工程公司、北京索萊寶生物技術有限公司購入相關試劑盒,包括肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、HE、Trizol、髓過氧化物酶(Myeloperoxidasedeficiency,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)、白介素-6(Interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

1.2.3 心臟損傷、心肌細胞自噬、PI3K/Akt/mTOR表達、氧化應激及炎癥指標檢測

1.2.3.1 心臟損傷:再灌注結束后,采集各組大鼠頸部血液標本5 ml,經4000 r/min離心8 min,取上清液,在酶聯免疫吸附試驗法中測定血清CK-MB、LDH水平,嚴格按照相關試劑盒說明書進行操作。處死大鼠后,將心臟用0.9%氯化鈉溶液充分洗滌,放置于-20 ℃環境下冷凍10 min,沿垂直心臟縱軸方向將其切成2 mm厚的薄片,置入1%TTC磷酸鹽緩沖液中,37 ℃水浴箱中避光孵育10 min,置于10%甲醛液中固定。正常心肌組織呈暗紅色,心肌梗死組織呈淡白色,應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算心肌梗死面積百分比。

1.2.3.2 心肌細胞自噬:運用Western blot法測定心肌組織中LC3、Beclin、P62蛋白表達,取大鼠心肌組織,置于液氮中碾碎,加入全細胞裂解液,于冰上裂解30 min,提取組織蛋白,應用BCA法測定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液和0.9%氯化鈉溶液配平后,將蛋白樣品煮沸5 min,取等量蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離、轉膜、封閉,加入一抗(1∶1000)4 ℃環境下孵育過夜,37 ℃環境下與相應二抗孵育2 h,ECL法顯色,應用Quantity One 2.6.2圖像分析系統分析蛋白條帶灰度值。

1.2.3.3 PI3K/Akt/mTOR表達:應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測定大鼠PI3K/Akt/mTOR表達:取大鼠心肌組織50 mg,給予10%中性甲醛固定,石蠟包埋、切片,HE染色,觀察組織病理形態變化,放入-80 ℃液氮中凍存備用。采用Trizol試劑提取總RNA,待標本鑒定合格后,行逆轉錄,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。qRT-PCR條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共進行35個循環。應用2-ΔΔCt法計算PI3K/Akt/mTOR mRNA表達量。

1.2.3.4 氧化應激指標:血液采集、血清制備方法同上,運用酶聯免疫吸附試驗法測定MPO、SOD、MDA水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3.5 炎癥指標:血液采集、血清制備方法同上述操作,采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平,嚴格按照相關試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1 各組大鼠心臟損傷比較 與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組血清CK-MB、LDH水平依次升高,且右美托咪定預處理組心肌梗死面積百分比明顯小于心肌缺血再灌注組,組間比較差異有統計學意義(均P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠心臟損傷比較

2.2 各組大鼠心肌細胞自噬比較 與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組心肌組織中LC3、Beclin、P62蛋白表達依次升高(均P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠心肌細胞自噬比較

2.3 各組大鼠PI3K/Akt/mTOR表達比較 與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組心肌組織中PI3K/Akt/mTOR表達依次下降(均P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠PI3K/Akt/mTOR表達比較

2.4 各組大鼠氧化應激指標比較 與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組血清MPO、MDA水平逐漸上升,而血清SOD水平逐漸降低(均P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠氧化應激指標比較

2.5 各組大鼠炎癥指標比較 與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平逐漸上升(均P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠炎癥指標比較(ng/L)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指心肌經歷缺血后恢復血流供應而造成心肌損傷加重的病理現象,其原因在于再灌注會產生大量氧自由基進而損害心肌組織,該現象是影響心臟疾病患者預后的重要原因[6-7]。研究發現,合理的藥物干預對于再灌注損傷的恢復具有積極作用,右美托咪定具有良好的鎮痛作用,對血流動力學影響小,可通過抑制炎癥反應、細胞凋亡等機制緩解心肌缺血再灌注損傷,但其作用機制尚不完全清楚[8-9]。

心肌缺血再灌注損傷的最終表現為心肌梗死面積增大,直觀反映了心臟損傷的嚴重程度;CK-MB、LDH是臨床常用的心肌損傷預警標志物,二者通常存在于細胞質中,當心肌組織因缺血缺氧受損時,心肌細胞膜被破壞,CK-MB、LDH由心肌細胞滲入到血液中,致使血清中濃度顯著升高[10-11]。本研究結果顯示,與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組血清CK-MB、LDH水平依次升高,且右美托咪定預處理組心肌梗死面積百分比明顯小于心肌缺血再灌注組,說明右美托咪定預處理能顯著減少心肌缺血再灌注大鼠心臟損傷,并縮小心肌梗死面積,與劉琨等[12]研究結果一致。

再灌注階段自噬表達過度增強不利于細胞存活[13-14]。LC3、Beclin、P62蛋白是細胞自噬的重要組成部分,可有效檢測心肌細胞自噬程度。機體對自噬過程的調控較為復雜,有多種信號通路參與其中,以PI3K/Akt/mTOR信號通路是最為突出。PI3K/Akt信號通路激活后導致Akt活化產生相應的生理效應,mTOR是PI3K/Akt信號通路下游最關鍵的自噬負調控因子,活化的Akt通過磷酸化作用激活mTOR信號通路,從而對自噬產生抑制作用;心肌缺血再灌注會導致氧化應激和炎癥反應,進而抑制mTOR蛋白表達及其磷酸化,使得mTOR對心肌細胞自噬的抑制作用減弱[15-16]。本研究結果顯示,與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組心肌組織中LC3、Beclin、P62蛋白表達依次升高,PI3K/Akt/mTOR表達則逐漸降低,意味著右美托咪定預處理針對心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機制可能與下調心肌細胞自噬蛋白表達,從而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。分析其原因在于,右美托咪定預處理能夠在一定程度上使PI3K/Akt/mTOR表達在心肌缺血再灌注過程中升高,從而抑制心肌細胞自噬的過度上調,減少對組織器官的損傷,產生心臟保護作用[17]。

在心肌缺血再灌注損傷的病理進程中,氧化應激和炎癥級聯反應占據著重要地位,在心肌缺血時,低氧狀態會引起細胞器損傷,激活心肌細胞過度自噬[18]。當發生心肌缺血再灌注損傷時,會破壞SOD活性,減弱機體抗氧化能力,造成細胞膜等結構破壞和功能損害;心肌缺血再灌注損傷引起缺血區域周圍心肌組織炎性浸潤,同時大量釋放炎癥細胞因子,進一步加重心肌損傷[19-20]。本研究結果顯示,與假手術組比較,右美托咪定預處理組、心肌缺血再灌注組血清MPO、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平依次升高,血清SOD水平則逐漸降低,意味著右美托咪定預處理可抑制心肌缺血再灌注大鼠炎癥因子表達、減輕氧化應激反應,這是因為右美托咪定通過激活α2受體發揮對炎性反應、氧化應激的抑制作用。

綜上所述,右美托咪定預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟功能具有保護作用,可抑制炎癥因子表達、減輕氧化應激反應,其作用機制可能與下調心肌細胞自噬蛋白表達,從而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。