腦鈉肽通過環磷酸鳥苷/蛋白激酶G信號通路對高血壓降壓效果及左心室肥厚逆轉作用的機制研究

馬宏恩,王 鑫,季朝紅,張 圓,魏文揚

(西安市第九醫院心血管內科,陜西 西安710054)

高血壓(Hypertension,HTN)是最常見的慢性心血管疾病之一,嚴重危害著人民的生命健康,同時造成了巨大的社會經濟負擔[1-2]。高血壓可由多種因素誘發,如遺傳、超重和肥胖、高鈉低鉀、長期精神緊張等均是導致高血壓的主要危險因素[3-4],而高血壓又可引起中風、心肌梗死、心力衰竭和慢性腎病等嚴重并發癥,其中在高血壓介導的器官損傷中,心肌肥厚對高血壓患者的病死率有著極其重要的影響[5-6]。持續高血壓可引起左心室肥厚、心肌纖維化等心肌損害,并導致惡性心律失常、心梗、心衰、猝死等心血管事件。目前臨床上主要通過血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體拮抗劑、利尿劑等藥物治療高血壓及其并發癥,但即便如此我國高血壓引發的心血管疾病仍依然呈不斷上升的趨勢[7]。近些年越來越多的研究發現腦鈉肽在治療心血管疾病中具有獨特的療效。馬計等[8]在研究中發現腦鈉肽對高血脂大鼠心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。然而到目前為止,腦鈉肽對高血壓左心室肥厚的作用還不明確。本研究通過構建高血壓左心室肥厚大鼠模型,并應用外源性腦鈉肽干預,檢測干預前、后心肌肥厚相關評價指標及心肌肥厚信號轉導通路中關鍵調控因子水平變化,旨在探討腦鈉肽對高血壓左心室肥厚是否具有保護作用及其作用機制,以期為高血壓左心室肥厚的臨床治療提供全新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器:重組人腦利鈉肽購自成都諾迪康生物制藥有限公司;蛋白激酶(PKG)抑制劑KT5823購自上海源葉生物科技有限公司;組織裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司;蛋白激酶Ⅰ(PKG-Ⅰ)抗體、轉化生長因子β1(TGF-β1)抗體、β-actin購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京博爾西科技有限公司;血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)檢測試劑盒、Smad家族成員3(Smad3)檢測試劑盒、Ⅲ型膠原檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。MK3/Multiskan Sky GO酶標儀購自美國賽默飛世爾雷勃公司;LW500T生物顯微鏡購自中國上海光電公司;生理檢測儀(MK-200ST)購自香港生科儀有限公司。

1.1.2 實驗動物:50只健康的清潔級雄性SD大鼠,體質量為220～260 g,年齡為8周齡,購買于江蘇艾菱菲生物科技有限公司。將所有大鼠常規飼養在動物房中,自由飲食飲水,并適應性飼養1周后進行后續實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建:隨機抽取10只大鼠作為對照組,除對照組外,其余組大鼠均參考文獻[9]采用腹主動脈縮窄法進行高血壓左心室肥厚大鼠模型構建:大鼠腹部注射戊巴比妥鈉全身麻醉后在無菌條件下沿腹部白線開腹,在雙腎動脈上方約5 mm處將7號針頭(直徑約0.7 mm)與腹主動脈共同結扎,抽出針頭,使腹主動脈縮窄約70%,縫合腹腔。觀察大鼠狀態,并于造模術后2周使用血壓計測量模型組大鼠收縮壓,與造模前比較,收縮壓上升20 mmHg以上,同時收縮壓高于135 mmHg即為造模成功。

1.2.2 藥物處理與分組:將所有實驗大鼠分為對照組、模型組、腦鈉肽組、腦鈉肽+PKG抑制劑(KT5823)組,每組10只,除對照組外,其余組均按照1.2.1高血壓左心室肥厚大鼠模型構建方法:對照組僅進行大鼠腹主動脈分離,不予結扎。所有大鼠術后連續3 d給予青霉素20萬單位腹腔注射抗感染,造模術后即開始給藥干預。腦鈉肽組每天通過微型泵以0.05 μg/(kg·min)的速率連續靜脈輸注腦鈉肽;腦鈉肽+KT5823組通過微型泵輸注相同劑量腦鈉肽的同時以0.01 μg/(kg·min)的速率連續靜脈輸注PKG抑制劑KT5823。造模(給藥)后2周測量各組血壓,造模(給藥)后4周處死各組大鼠,分離心肌組織。

1.2.3 各組大鼠收縮壓的測定:分別在各組大鼠造模前、造模(給藥)后2、4周采用尾袖法檢測其在安靜、清醒狀態下的收縮壓水平。

1.2.4 Western blot檢測各組大鼠心肌組織PKG-Ⅰ、TGF-β1蛋白表達情況:收集各組大鼠心肌組織,加入組織裂解液,裂解各組大鼠組織,并進行勻漿。4 ℃條件下離心(12000 r/min,5 min)后收集上清,提取總蛋白。并使用BCA法對提取的蛋白進行定量。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉膜后使用5%的脫脂奶粉在室溫下進行封閉,2 h后加入一抗稀釋液(1∶1000),并在4 ℃條件下進行孵育過夜,第二天使用TBS進行清洗,然后加入IgG二抗稀釋液(稀釋比例為1∶2000),室溫下繼續孵育2 h后進行TBS清洗,顯色后觀察各組PKG-Ⅰ、TGF-β1蛋白表達水平。

1.2.5 各組大鼠LVW/TL比值的測量:收集各組大鼠心臟,取左心室及室間隔部分,用濾紙吸干水分后稱取左心室質量(LVW),同時分離各組大鼠左脛骨并測量其長度(TL),最后計算LVW/TL比值。

1.2.6 各組大鼠心肌組織血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、Smad3、Ⅲ型膠原含量的檢測:取各組大鼠心肌組織,制備組織勻漿后進行離心(3000 r/min,20 min),收集上清,然后分別使用AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原檢測試劑盒,嚴格按照操作說明檢測各組大鼠心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原的含量。

1.2.7 ELISA檢測各組大鼠心肌組織ROS、MDA和SOD含量:取各組大鼠心肌組織,制備組織勻漿后進行離心(3000 r/min,10 min),收集上清,然后分別使用ROS、MDA、SOD檢測試劑盒,嚴格按照操作說明檢測各組大鼠心肌組織中ROS、MDA、SOD的含量。

1.2.8 MASSON法檢測各組大鼠心肌組織形態學:收集心肌組織,使用4%的多聚甲醛進行固定,然后進行常規石蠟切片(將固定組織脫水后進行石蠟包埋,制備5 μm切片),最后進行MASSON染色,觀察各組大鼠心肌組織纖維化程度。

2 結 果

2.1 腦鈉肽對各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號通路的比較 由表1(圖1)可見,與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達量顯著增加(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號通路相關蛋白表達的比較

表1 各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號通路相關蛋白表達量的比較

2.2 腦鈉肽對各組大鼠收縮壓的比較 由表2可見,各組大鼠之間造模前收縮壓均無統計學差異(均P>0.05);與對照組比較,模型組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓顯著上升(均P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓均顯著降低(均P<0.05);與腦鈉肽組大鼠比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓顯著回升(均P<0.05)。

表2 腦鈉肽對各組大鼠收縮壓的比較(mmHg)

2.3 腦鈉肽對各組大鼠左心室LVW/TL以及心肌組織AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原含量的比較 由表3可見,與對照組比較,模型組大鼠LVW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著增加(均P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠LVW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著降低(均P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠VW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著回升(均P<0.05)。

表3 各組大鼠LVW/TL以及心肌組織AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原含量比較

2.4 腦鈉肽對各組大鼠氧化應激相關指標的比較 由表4可見,與對照組比較,模型組大鼠ROS水平和MDA含量顯著增加(均P<0.05),而SOD水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量顯著降低(均P<0.05),而SOD水平明顯增加(P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量顯著增加(均P<0.05),而SOD水平明顯降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織ROS、MDA及SOD水平比較

2.5 腦鈉肽對各組大鼠心肌組織纖維化的比較 MASSON實驗檢測各組大鼠心肌組織纖維化情況顯示,與對照組比較,模型組大鼠心肌組織發生明顯纖維化改變,腦鈉肽干預后,大鼠心肌纖維化有所改善,而KT5823逆轉了腦鈉肽對心肌纖維化的改善作用(圖2)。

圖2 MASSON實驗檢測各組大鼠心肌組織纖維化情況(MASSON染色,×300)

3 討 論

腦鈉肽與其受體結合后可激活細胞內鳥苷酸環化酶,使三磷酸鳥苷(GTP)轉變為環磷酸鳥苷(cGMP),進而激活PKG。哺乳動物細胞中存在PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ兩種同功異構體。其中PKG-Ⅰ主要表達在心臟、腎血管、肺等組織中,它對心血管系統具有多種調節作用,cGMP正是通過激活PKG-Ⅰ調控大量目的蛋白發揮生物學功能[10]。胡軍等[11]研究表明,cGMP/PKG信號通路的激活可對嗎啡處理后的大鼠具有心肌保護作用。且已有研究證實腦鈉肽可通過激活cGMP/PKG信號通路保護心肌組織[12]。本研究發現:模型大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號通路相關蛋白PKG-Ⅰ和心肌肥厚相關蛋白TGF-β1表達水平分別顯著下調和上調,而腦鈉肽治療后,模型大鼠心肌組織中PKG-Ⅰ和TGF-β1表達水平分別明顯回升和回落,提示腦鈉肽可能通過調節cGMP/PKG信號通路對高血壓左心室肥厚大鼠發揮保護作用。

收縮壓是心臟收縮時血液對血管內壁的壓力,是反映機體高血壓的一個重要指標。本研究中我們發現:模型大鼠的收縮壓顯著升高,且收縮壓高于135 mmHg,而腦鈉肽治療后,模型大鼠的收縮壓顯著降低,提示腦鈉肽對高血壓具有一定的降壓療效。研究還發現:應用cGMP/PKG信號通路的抑制劑KT5823處理模型大鼠后,可逆轉腦鈉肽對高血壓大鼠的降壓作用,說明腦鈉肽對模型大鼠血壓的調節作用是通過cGMP/PKG信號通路實現的。

心室肥厚是高血壓導致心臟損傷的一種主要表現,研究已經證實在心臟受損時,AngⅡ、Smad3和Ⅲ型膠原均被激活,并誘導膠原蛋白加速合成,誘發心臟纖維化和心肌肥厚[13-14]。在本研究中,模型組大鼠LVW/TL比值明顯增加,同時大鼠心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平均顯著上升,心肌組織可見纖維化改變,提示模型大鼠發生明顯的心肌肥厚;而腦鈉肽治療后,大鼠LVW/TL比值以及心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平均顯著降低,心肌纖維化有所改善,提示腦鈉肽可抑制高血壓誘發的心肌肥厚。本研究還發現:KT5823逆轉了腦鈉肽對LVW/TL比值以及AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平的影響,同時逆轉了腦鈉肽對模型大鼠心肌纖維化的改善作用,這些結果均表明腦鈉肽可通過調控cGMP/PKG信號通路影響高血壓左心室肥厚的進展。

氧化應激在整個高血壓病程中都扮演著重要的角色,氧化應激是指當機體受到損傷時,會產生過多的ROS,ROS如果過量或不能及時清除會發生氧化反應,導致細胞損傷。氧化應激發生時,將產生過多的有害物質,如MDA,它是ROS攻擊體內脂肪所產生的氧化物,可以引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合,引起DNA損傷,具有一定的細胞毒性,其含量的多少常被作為評價氧化損傷程度的指標。SOD能清除體內有害的ROS,從而減輕ROS對機體造成的損害,對抗氧化應激反應。大鼠體內實驗已經證實,當合并高血壓時,大鼠會發生血管氧化應激反應,這表明氧化應激與高血壓緊密相關[15-17]。而心肌肥厚所導致的缺血缺氧同樣可促使心肌細胞發生氧化應激反應,產生更多的ROS,從而引起心肌纖維化和心室肥厚的進一步加重[18-20],并不斷重復上述過程形成惡性循環。我們的研究發現:模型大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著增加,而SOD水平明顯降低,提示模型大鼠發生嚴重的氧化應激反應,而腦鈉肽治療后,其ROS和MDA水平均明顯回落,且SOD水平顯著回升,提示腦鈉肽可抑制高血壓和心肌肥厚所誘發的氧化應激反應。同時本研究還發現KT5823削弱了腦鈉肽對模型大鼠心肌組織中氧化應激指標的影響,這表明腦鈉肽可通過調控cGMP/PKG信號通路影響高血壓左心室肥厚所產生的氧化應激水平。

綜上所述,腦鈉肽可通過調控cGMP/PKG信號通路降低高血壓左心室肥厚大鼠血壓,減輕其氧化應激水平,同時改善其左心室肥厚程度。