重癥哮喘兒童血漿脂質代謝特征與潛在生物標志物研究

鄭紅梅 溫亞錦 韓曉 馮瑞 劉麗娟 陳仁杰 李小玲 金婷婷 周玉峰，5 張曉波△

（1國家兒童醫學中心/復旦大學附屬兒科醫院呼吸科， 2兒科研究所 上海 201102； 3復旦大學計算機科學技術學院 上海 200433；4復旦大學公共衛生學院環境衛生學教研室 上海 200032； 5復旦大學生物醫學研究院 上海 200032）

支氣管哮喘是兒童最常見的慢性疾病。2010年，我國城市0～14歲兒童哮喘患病率為3.02%，近年又呈逐年上升趨勢［1］。大多數兒童在吸入中低劑量的糖皮質激素后癥狀得到控制，但有約2.5%～5%［2-3］的重癥哮喘兒童需要吸入高劑量糖皮質激素來控制癥狀。重癥哮喘兒童雖然占比較小，但由于住院和急診就醫頻率顯著增加，帶來了巨大的衛生資源負擔。與輕中度哮喘相比，重癥哮喘兒童年度醫療費用是其兩倍［4-5］。因此，提高重癥哮喘的診治有利于改善哮喘的整體控制水平，降低醫療成本。

既往研究顯示，外周血嗜酸性粒細胞和血清IgE濃度是預測哮喘急性加重或者高惡化風險的重要生物標志物［6-7］，但對于預測重癥哮喘的特異性生物標志物目前尚無統一結論。近年來，代謝組學方法在篩選與疾病發生發展相關的生物標志物研究中得到廣泛應用。代謝組學旨在探究生物體內小分子代謝物成分及其在生理病理中的整體動態變化規律，強調對代謝組分的定量和定性分析［8］。既往多項工作［9-15］揭示了與哮喘發生發展顯著相關的代謝物和代謝途徑，前者包括腺苷、丙氨酸等，后者包括脂質代謝、三羧酸循環等，但結果并不一致。值得注意的是，近年來國外研究報道脂質代謝在兒童哮喘的控制中發揮重要作用［13］。鑒于哮喘是由基因和環境共同誘發的異質性疾病，人群的基因遺傳易感性在其發生發展中發揮重要作用，所以在我國特有的與環境和飲食相適應的遺傳基礎上，研究重癥哮喘與輕中度哮喘兒童脂質差異特征具有重要意義。

本研究采用液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術對重癥哮喘和輕中度哮喘兒童的血漿進行非靶向脂質代謝組學檢測，探索重癥哮喘兒童體內脂質成分的改變，并篩選重癥哮喘兒童的潛在血漿標志物，以期為重癥哮喘的臨床診治提供新思路。

資料和方法

研究對象本研究數據來源于復旦大學附屬兒科醫院哮喘專病數據庫。哮喘患者入組后即完成社會人口學和基線臨床信息收集和評估，并納入哮喘專病管理；哮喘專病庫定期向哮喘兒童推送哮喘隨訪問卷，以評估患者的哮喘控制、藥物依從性、哮喘加重等情況，并在入組后第3、6、9和12個月時安排患者進行哮喘專病門診的隨訪和評估。選取2020年9月1日—2021年4月30日入組哮喘專病數據庫且入組時已規范化治療和管理1年以上，被診斷為重癥哮喘的兒童。根據重癥哮喘兒童性別、年齡，從哮喘專病數據庫中1：1匹配輕中度哮喘兒童。最終納入50例重癥哮喘和54例輕中度哮喘兒童。本研究獲得復旦大學附屬兒科醫院倫理委員會的批準（批準號：2018-215），患兒家屬均簽署知情同意書。

納入標準 結合2020版GINA及我國兒童支氣管哮喘診治建議，本院哮喘專病門診嚴格管理并診斷重癥哮喘［3，16］。重癥哮喘納入標準：（1）符合我國兒童哮喘防治指南中哮喘的診斷標準；（2）排除患兒依從性不良、藥物吸入技術錯誤，并排除誘發加重或使哮喘難以控制的因素；（3）在過去1年中需要使用第4級或第5級哮喘藥物治療以防止變成為“未控制”哮喘，或即使在上述治療下仍表現為“未控制”哮喘。輕中度哮喘：（1）符合我國兒童哮喘防治指南中哮喘的診斷標準；（2）使用第3級或以下哮喘藥物治療能達到良好控制的哮喘。

排除標準 兩組均排除以下兒童：（1）存在未控制的胃食管反流、睡眠呼吸暫停、鼻竇炎、心理疾病等共存疾病；（2）患有遺傳代謝病、先天性心臟病等基礎疾病；（3）無法配合完成肺通氣功能和呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）檢測；（4）家屬拒絕提供臨床信息及血液樣本。

臨床資料收集與樣本采集在哮喘兒童接受規范化管理和治療12個月后，哮喘專科醫師根據納入標準納入重癥哮喘兒童，收集患兒血常規、肺通氣功能、FeNO、外周血嗜酸性粒細胞計數（eosinophils，EOS）等臨床資料，同時采集重癥哮喘兒童空腹靜脈血1 mL。重癥哮喘兒童納入后，專科醫師在哮喘專病數據庫中根據年齡、性別，1∶1匹配輕中度哮喘兒童，并收集相同的臨床信息和靜脈血標本。所有血漿樣本均于2 h內以3 000×g速度離心10 min，留取血漿上清液，凍存于-80 ℃冰箱，用于代謝組學分析。

試劑與儀器甲醇、乙腈、異丙醇、水等均為色譜純，氯仿為分析純（均購自美國Thermo Fisher公司）。高分辨質譜儀（QE plus）、高效液相色譜儀（Dionex U3000）均購自美國Thermo Fisher公司，色譜柱購自美國Waters公司ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

血漿代謝分子水平檢測委托上海歐易生物醫學科技公司檢測。

脂質提取 從-80 ℃取出血漿，取100 μL上清液，加入10 μL內標（L-2-氯苯丙氨酸）和300 μL氯仿-甲醇（體積2∶1），渦旋震蕩30 s，靜置30 min后離心（12 000 r/min，離心半徑178.6 mm，4 ℃，10 min，后續離心條件相同）。取出200 μL下層氯仿裝入新的離心管。在剩余液體中加入200 μL氯仿-甲醇（體積2∶1），超聲提取10 min，離心后再次取出200 μL下層氯仿，加入上一步新的離心管中，進行揮干。揮干后的殘渣用200 μL異丙醇-甲醇（體積1∶1）復溶，離心后留取150 μL上清用于LC-MS分析。

LC-MS檢測 柱溫：55 ℃；流動相A由乙晴和水（體積6∶4，包含10 mmol/L乙酸銨）組成，流動相B由異丙醇和乙晴（體積9∶1，包含10 mmol/L乙酸銨）組成；流速為0.26 mL/min；進樣5 μL。洗脫梯度：1～15 min，68%流動相A和32%流動相B；15～18 min，3%流動相A和97%流動相B；18～21 min，68%流動相A和32%流動相B。質譜參數：采集范圍100～1 200m/z，電壓3.8（+）/3.8（-） KV，離子源溫度和脫溶劑氣溫為350 ℃。霧化脫溶氣體為氮氣。

統計學處理臨床資料數據采用SPSS 25.0統計軟件進行分析。正態分布的計量資料采用描述，偏態分布的計量資料采用M（Q1，Q3）描述，計數資料以率（%）描述，分別采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗和χ2檢驗進行兩組組間比較。脂質組學數據采用LipidSearch對原始數據進行峰識別、峰提取、脂質鑒定等預處理。處理后通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA）進行多元統計分析，并進行置換檢驗。根據變量權重值（variable importance in projection，VIP）＞1，篩選組間有差異的脂質分子。選取P＜0.05且VIP＞1的脂質進行代謝通路富集分析。利用變異倍數（fold change，FC）＞2和P＜0.05篩選顯著差異的特征脂質分子。通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估臨床指標與顯著差異代謝分子的預測價值。

結 果

一般資料共納入104例研究對象：重癥哮喘組50例，其中男性34例（68.0%），年齡（8.8±2.6）歲；輕中度哮喘54例，其中男性38例（70.4%），年齡（8.4±2.8）歲。兩組間年齡、性別差異無統計學意義（P=0.075，0.422，表1）。

表1 重癥哮喘組與輕中度哮喘組臨床資料比較Tab 1 Clinical characteristics of severe asthma and mild-to-moderate asthma ［n（%） or or M（Q1，Q3）］

表1 重癥哮喘組與輕中度哮喘組臨床資料比較Tab 1 Clinical characteristics of severe asthma and mild-to-moderate asthma ［n（%） or or M（Q1，Q3）］

BMI： Body mass index； compared with growth charts for children who are the same age and sex， healthy weight is a BMI between the 5th to the 85th percentile， overweight is a BMI between the 85th percentile and the 95th percentile， obesity is a BMI in the 95th percentile or above. C-ACT：Childhood asthma control test. EOS： Eosinophils； FeNO： Fractional exhaled nitric oxide； FEV1： Forced expiratory volume in 1 second； FVC：Forced vital capacity； PEF： Peak expiratory flow； FEF25： Forced expiratory flow at 25% of the pulmonary volume； FEF50： Forced expiratory flow at 50% of the pulmonary volume； FEF75： Forced expiratory flow at 75% of the pulmonary volume； MMEF： Forced expiratory flow at 25%-75% of the pulmonary volume.

Severe asthma （n=50）Mild-to-moderate asthma （n=54）Variable Sex Male Female Age （y）BMI ［kg/m2］Healthy weight Overweight Obesity C-ACT scores Course of asthma （y）EOS count （n/μL）EOS percentage FeNO （ppb）% Predicted FVC% Predicted FEV1 FEV1/FVC ratio% Predicted PEF% Predicted FEF25% Predicted FEF50% Predicted FEF75% Predicted MMEF t/z/χ2 0.259 P 0.796 34 （68.0）16 （32.0）8.8±2.6 38 （70.4）16 （29.6）8.4±2.8 0.471 6.793 0.639 0.033＜0.001＜0.001 0.029 0.023 0.051 0.862 0.079 0.003 0.670 0.056 0.005 0.005 0.003 18 （36.0）13 （26.0）19 （38.0）19.26±2.00 3.76±2.96 325 （202， 502）4.65 （2.93，7.63）25 （10， 39）96.29±14.56 94.62 （85.27，105.07）83.65±7.11 89.73±17.08 85.88±20.59 75.18±23.79 65.43±23.51 74.16±22.11 33 （61.1）10 （18.5）11 （20.4）23.70±3.09 1.16±1.00 157.5 （230， 372）2.95 （1.80， 6.25）17 （9， 24）96.75±12.71 102.17 （90.43，112.88）87.97±7.40 91.27±19.54 93.88±21.51 88.54±23.23 81.12±30.96 88.45±24.77-1.870-5.878-2.186-2.271-1.954-0.174-1.757-3.029-0.427-1.935-2.899-2.892-3.095

重癥哮喘和輕中度哮喘臨床指標比較與輕中度哮喘相比，重癥哮喘兒童肥胖比例更高、CACT評分更低、哮喘病程更長（P=0.033，＜0.001，＜0.001）。實驗室檢測中，重癥哮喘組EOS計數、EOS百分比均高于輕中度哮喘組（P=0.029，0.023）。肺通氣功能檢測中，重癥哮喘組FEV1/FVC、FEF50%預計值、FEF75%預計值及MMEF%預計值均低于輕中度哮喘組（P=0.003，0.005，0.005，0.003）；以上差異均有統計學意義（表1）。

重癥哮喘和輕中度哮喘的脂質分子差異比較脂質組學PCA圖顯示，重癥哮喘組和輕中度哮喘組血漿分離趨勢不明顯（圖1A），進一步采用PLS-DA模型分析，結果顯示兩組分離趨勢明顯（圖1B）。在PLS-DA的基礎上，通過OPLS-DA模型去除噪音，結果顯示兩組的分離趨勢進一步明顯（圖1C）。對OPLS-DA模型進行置換驗證（R2=0.0476，Q2=-0.489），顯示OPLS-DA模型未過擬合（圖1D），提示模型穩健，可成功區分兩組樣本。

圖1 重癥哮喘組與輕中度哮喘組兒童脂質組學多元統計分析Fig 1 Multiple statistical analysis of plasma metabolic profiling in children with severe asthma and mild-to-moderate asthma

差異脂質分子篩選與聚類分析基于LC-MS法對全部血漿樣本進行非靶向脂質檢測，共篩選出1 578個差異代謝分子。以VIP＞1、P＜0.05作為篩選標準，得到差異脂質39個，歸屬于6個亞類。與輕中度哮喘相比，重癥哮喘組中表達上調的29個，下調的10個。在這39種差異脂質中選取VIP＞1的前20名的表達量對兩組樣本進行層次聚類。結果顯示（圖2），與輕中度哮喘組相比，重癥哮喘組有8種磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、5種鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、1種磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、1種磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、1種磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）顯著性上調；3種溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、1種磷脂酰乙醇胺顯著性下調。其中，在兩組間有顯著差異（FC＞2，P＜0.05）的脂質分子為PS（40∶2）和PE（47∶10），均在重癥哮喘中表達下調。

圖2 重癥哮喘組與輕中度哮喘組VIP前20種脂質熱圖比較Fig 2 The heat map of relative abundance of VIP-top 20 plasma lipid species in severe asthma group and mild-to-moderate asthma group

差異脂質分子代謝通路富集分析采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數據庫對以上20種差異脂質分子進行代謝通路富集分析，結果顯示重癥哮喘組中受干擾的通路有膽堿代謝、甘油磷脂代謝、逆行內源性大麻素信號、亞油酸代謝、α亞油酸代謝和花生四烯酸代謝（表2）。

表2 代謝通路富集分析結果Tab 2 Relevant metabolic pathways were analyzed by KEGG

受試者工作特征（ROC）曲線分析將兩組間有統計學意義的6個差異臨床指標（EOS、EOS%、FEV1/FVC、FEF50%預計值、FEF75%預計值、MMEF%預計值）作為基線，進行ROC曲線評估。并將可能具有診斷潛力的脂質分子PE（47∶10）和PS（40∶2）分別與基線進行聯合ROC曲線分析。結果顯示，基線、基線聯合PE（47∶10）和基線聯合PS（40∶2）的曲線下面積分別是0.737（95%CI：0.640～0.834）、0.928（95%CI：0.851～1.000）和0.923（95%CI：0.863～0.983）（圖3）。提示臨床指標聯合顯著差異脂質分子PE（47∶10）或PS（40∶2）后，均能提高對重癥哮喘兒童的診斷準確度。

圖3 PE（47∶10）和PS（40∶2）用于鑒別重癥哮喘和輕中度哮喘兒童的受試者工作特征曲線分析Fig 3 Receiver operating characteristic curves analysis of lipid species PE（47∶10）and PS（40∶2） in discriminating children with severe asthma and mild-to-moderate-asthma

討 論

研究發現不同表型的哮喘患者體內代謝模式有所區別。脂質通過炎癥反應、氧化應激等參與哮喘的發展，影響哮喘的結局，越來越多地引起了人們的關注［17-19］。近來國外研究發現花生四烯酸與亞油酸代謝在兒童哮喘的控制中發揮重要作用，且可用脂質代謝預測未控制的哮喘［13］。本研究應用脂質組學技術對50例重癥哮喘和54例輕中度哮喘兒童的血漿進行了檢測，探討了不同哮喘的脂質差異，發現39個主要差異脂質分子。差異的脂質成分主要為PC、SM、PE、PS、PI和LPC 6類，代謝通路富集分析顯示膽堿代謝紊亂最為顯著。

在本項研究中，我們分析了重癥和輕中度哮喘兒童的臨床指標，發現重癥哮喘兒童BMI更高、病程更長。既往研究揭示肥胖顯著影響兒童哮喘的藥物治療敏感性。Reyes-Angel等［20］發現超重肥胖的哮喘兒童對吸入性糖皮質激素藥物治療的反應性更差。Bapat等［21］在肥胖的哮喘小鼠體內發現，Th2細胞介導的免疫炎癥反應更多地轉化為Th17細胞介導的炎癥類型，從而導致小鼠炎癥反應加重和藥物耐受。與過往研究一致，本研究中發現與輕中度哮喘兒童相比，重癥哮喘兒童BMI更高，進而可能加劇了重癥哮喘對激素不敏感。

重癥哮喘的代謝組學研究對于早期發現代謝標志物、預測治療反應和指導個體化靶向治療具有重要價值［22-23］，但目前重癥哮喘代謝組學的相關研究較少，重癥哮喘早期代謝標志物的意義尚不明確。本研究發現了不同嚴重程度哮喘存在血漿脂質代謝差異，并且以膽堿代謝紊亂最為顯著。膽堿是一種人體必需的營養素，可轉化為S-腺苷甲硫氨酸、乙酰膽堿等作為甲基供體參與神經活動。隊列研究發現，哮喘患者補充膽堿6個月，可顯著降低氣道阻力、EOS百分比、總IgE水平，以及IL-4、IL-5、TNF-α水平［24］，提示大劑量補充膽堿可以抑制哮喘患者體內炎癥和氧化應激。但是，Columbo等［25］發現，老年哮喘患者在補充膽堿6周后，肺通氣功能、外周血EOS百分比、總IgE水平和ACT得分無明顯改變。因此，膽堿在哮喘中的作用尚需更多研究來驗證。

同時，我們發現EOS、EOS%、FEV1/FVC、FEF50%預計值、FEF75%預計值、MMEF%預計值在重癥和輕中度哮喘兒童間有差異，并以此為ROC曲線分析的基線。ROC曲線分析結果顯示，差異脂質中變異倍數最大的PS（40∶2）和PE（47∶10）的AUC、靈敏度和特異性均高于基線，提示PE（47∶10）和PS（40∶2）可能是重癥哮喘診斷的潛在生物標志物。

PE是體內含量豐富的甘油磷脂，廣泛參與多種生命過程，如促進氧化磷酸化、自噬、內質網應激、促進鐵沉積等［26-27］。研究發現，成人女性哮喘患者血清中PE含量高于男性哮喘患者［28］；在健康成人、輕度哮喘和中度哮喘中，PE（38∶1）、PE（18∶1p/22∶6）和PE（20∶0/18∶1）的水平差異有統計學意義；與正常健康人群相比，哮喘患者體內PE水平顯著升高，且PE表達水平與哮喘的嚴重程度、IgE水平呈正相關［29］；同樣，動物實驗中發現氣道阻力明顯上升的小鼠支氣管肺泡灌洗液中PE水平顯著升高，提示PE與氣道阻力正相關［30］。值得注意的是，研究揭示吸煙、感染等哮喘危險因素可降低GPX4活性，從而通過增加脂質過氧化導致磷脂氧體的結構和功能平衡改變，導致上皮細胞功能障礙甚至鐵死亡［31］，而PE作為細胞膜的主要成分，其解離程度與細胞發生鐵死亡的比例正相關［27］。因此，這在一定程度上提示PE與哮喘的發生密切相關，但PE（47∶10）與重癥哮喘的關聯機制仍需進一步探討。

PS可以由PE在磷脂酰乙醇胺絲氨酸轉移酶的作用下生成，并在生物酶生成和激活過程中扮演關鍵角色［32-33］。研究發現，PS是唯一與T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域（T cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）受體結合的非蛋白分子［34］。而TIM是哮喘和過敏的重要易感基因，優先表達于Th2細胞，并作為有效共刺激分子激活T細胞。進一步在小鼠實驗中發現，TIM高表達與Th2細胞比例、氣道炎癥程度和氣道高反應性正相關［35］，同時Goth等［36］發現PS特異性地促進了蛋白質抗原誘導的大鼠肥大細胞釋放組胺，從而誘導氣道平滑肌痙攣。因此，我們猜測PS（40∶2）可能通過與TIM結合，促進肥大細胞釋放組胺和Th2型炎癥發生，從而導致重癥哮喘，然而這需要進一步體內外研究進行論證。

本研究初步探究了國內重癥哮喘和輕中度哮喘兒童血漿脂質代謝差異，發現相關差異表達脂質分子。本研究也具有一定的局限性：首先，重癥哮喘組與輕中度哮喘組兒童治療用藥存在不同，尤其吸入糖皮質激素劑量及療程不同可能在一定程度上影響代謝組學。雖然既往Picado等［37］、Sparreman等［17］的研究提示激素治療本身對患者血漿脂類代謝、蛋白組學可能影響較小，但相關研究不多且尚無明確結論。其次，單次代謝組學檢測提供的是靜態的代謝分子豐度信息，而哮喘是一個慢性炎癥性疾病，機體代謝處于動態變化中，并受飲食模式等多種因素的影響，因此無法完全展示重癥哮喘兒童體內代謝情況。此外，本研究僅探究了重癥哮喘兒童的差異代謝分子，尚未對發現的差異代謝分子進行靶向驗證。因此，需要在本研究的基礎上進行前瞻性研究，通過進一步擴大樣本量、靶向代謝檢測等深入探討代謝分子在重癥哮喘發生發展中的作用。

綜上所述，本研究通過脂質組學檢測，初步探究了國內重癥哮喘和輕中度哮喘兒童血漿脂質代謝差異。通過代謝通路富集分析發現差異脂質分子主要集中在膽堿代謝通路，并將變異倍數最大的PE（47∶10）和PS（40∶2）與臨床指標聯合分析，可提高對重癥哮喘的診斷。在后續的研究中，可通過擴大樣本量、聯合多組學等進行更深入地探索重癥哮喘的發病機制，為重癥哮喘的診斷和治療提供新的思路。

作者貢獻聲明鄭紅梅 實驗設計與研究，數據分析和論文撰寫。溫亞錦 實驗研究，數據分析，論文撰寫。韓曉 實驗設計，論文修訂。馮瑞研究咨詢，數據分析。劉麗娟 數據分析，論文修訂。陳仁杰 數據分析。李小玲，金婷婷 文獻調研與整理。周玉峰 研究設計，可行性分析。張曉波 研究設計，監督指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。