高效液相色譜—蒸發光檢測器測定石斛夜光丸的5種成分

李麗莉 白桂昌 羅 軼 覃麗酈 呂軼峰　

高效液相色譜—蒸發光檢測器測定石斛夜光丸的5種成分

李麗莉 白桂昌 羅 軼 覃麗酈 呂軼峰

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

目的：建立同時測定石斛夜光丸人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，麩炒枳殼中新橙皮苷、柚皮苷的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜－蒸發光散射法（HPLC-ELSD），流動相為乙腈－水梯度洗脫，空氣流速2.0 L/min，漂移管溫度為110℃。采用建立的方法對樣品進行測定，并使用R語言對結果進行分析。結果：所測5種成分在各自線性范圍線性關系良好，相關系數r均大于0.999 6，精密度、重復性、穩定性RSD均小于2.95%，平均回收率為96.7%～99.5%，RSD均小于1.90%。使用R語言對結果進行分析，不同廠家的石斛夜光丸5種成分含量差異顯著。結論：該方法簡便快捷、穩定，測定結果準確可靠，實現了對石斛夜光丸中麩炒枳殼、人參的質量評價，一方面為進一步提升石斛夜光丸的整體質量控制水平奠定基礎，另一方面也為不同廠家石斛夜光丸的質量對比研究提供參考。

石斛夜光丸；麩炒枳殼；人參；R語言；HPLC-ELSD

引言

石斛夜光丸由石斛、人參、山藥、茯苓、甘草、肉蓯蓉、枸杞子、菟絲子、地黃、熟地黃、五味子、天冬、麥冬、苦杏仁、防風、川芎、麩炒枳殼、黃連、牛膝、菊花、鹽蒺藜、青葙子、決明子、水牛角濃縮粉、山羊角等25味藥材組成，被收錄于《中國藥典》2020年版一部[1]，具有滋陰補腎、清肝明目的功效。

本品現行質量標準僅控制了黃連1味藥的含量，未對其中貴細藥材人參進行含量控制，控制指標不全面。

此外，本品處方中有枳殼藥材。枳殼與青皮性狀相近[2,3]，但成分上有所不同。青皮中含蕓香柚皮苷、橙皮苷，不含柚皮苷、新橙皮苷，枳殼中含柚皮苷、新橙皮苷[4-7]。石斛夜光丸現在標準中采用薄層鑒別的方法，以柚皮苷、新橙皮苷為對照品，對枳殼進行定性控制。采用該方法實驗，蕓香柚皮苷、橙皮苷（青皮中含有），柚皮苷、新橙皮苷斑點顏色一致（枳殼中含有），Rf值也較為接近，該方法不能有效鑒別石斛夜光丸中投的是枳殼還是青皮，因此建議采用靈敏度、專屬性更高的方法對枳殼進行含量控制。

為能更好地反映石斛夜光丸樣品的質量，本文采用HPLC- ELSD法建立了石斛夜光丸人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1以及麩炒枳殼中含量較高的新橙皮苷、柚皮苷的含量測定方法[8-10]，為合理評價石斛夜光丸的質量提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 試藥與樣品

1.1.1 試藥

柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110722-201815，含量91.7%）；新橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：11857-201804，含量99.4%）；人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110703-201933，含量93.4%）；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110754-202028，含量93.9%）；人參皂苷Rb1對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含測用，批號：110704-202028，含量93.1%）。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.1.2 樣品

57批石斛夜光丸均為水蜜丸，來自9個不同的生產企業。

1.2 儀器

Waterse2695高效液相色譜儀，AllChrom ELSD6000蒸發光散射檢測器，ML204型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為CAPCELLPAK MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈－水系統；色譜梯度洗脫：0～25 min、14%乙腈，25～45 min、14%～20%乙腈，45～63 min、20%～24%乙腈，63～70 min、24%～28%乙腈，70～82 min、28%～33%乙腈，82～95 min、33%乙腈，95～102 min、33%～38%乙腈，102～105 min、38%乙腈；流動相流速1.0 mL/min，空氣流速2.0 L/min；漂移管溫度110℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、對照品適量，加甲醇制成質量濃度為0.458 0、0.573 0、0.100 2、0.092 2、0.203 5 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

取樣品，研碎，取6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，稱定重量，加熱回流1小時，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液50 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

分別精密吸取對照品混合溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測定，以峰面積對數值為縱坐標()，對照品進樣量對數值為橫坐標()，計算回歸方程，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.4.2 精密度試驗

取“2.2”項下的樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積并計算RSD，RSD分別為2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗

取同一批石斛夜光丸，按“2.3”項下方法各平行制備6份樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析。新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量分別為0.8598 mg·g-1（RSD=1.79%）、07313 mg·g-1（RSD=2.46%）、0.1854 mg·g-1（RSD=1.44%）、0.3968 mg·g-1（RSD=1.47%）、0.3043 mg·g-1（RSD=0.62%），RSD均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗

取“2.2”項下的同一供試品溶液，分別于0、4、8、14、20、24 h，按“2.1”項下色譜條件分析，計算新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的峰面積并計算RSD，RSD分別為2.68%、2.95%、2.94%、2.45%、1.26%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 加樣回收實驗

稱取石斛夜光丸6份，精密稱定，計算樣品中新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量，以樣品含量與對照品加入量1∶1的比例，分別加入對照品，按“2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1回收率分別為99.3%（RSD=1.40%，=6）、96.2%（RSD=0.64%，=6）、99.5%（RSD=1.90%，=6）、96.7%（RSD=1.49%，=6）、96.7%（RSD=1.52%，=6），回收率在95%～100%之間，表明回收率實驗符合要求，方法的準確度良好。

2.6 樣品測定及結果

取不同廠家、不同批號石斛夜光丸57批，按“2.1”項下色譜條件進行分析，對樣品中所含新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進行測定，結果見表1、表2。其中G、H、I三家企業未檢出新橙皮苷、柚皮苷峰，檢出其它兩個色譜峰，經確認為橙皮苷與云香柚皮苷峰。所有企業均檢出人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰，但C企業樣品及E、F企業的部分樣品人參皂苷Rb1峰含量相對偏高。

表2 57批石斛夜光丸5種成分含量測定結果表

表2（續）

生產企業批號柚皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1人參皂苷Rg1/mg·g-1人參皂苷Re/mg·g-1人參皂苷Rb1/mg·g-1 G190501000.060.160.21 200101000.060.160.25 191001000.040.120.20 H190505000.020.030.06 191006000.100.120.18 191202000.100.220.37 191004000.080.100.16 200104000.080.200.31 191107000.120.330.52 191102000.120.240.38 I191004000.040.100.17

2.7 化學計量分析

本文方法測定采用新橙皮苷、柚皮苷作為枳殼的指標成分，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1作為人參的指標成分，通過測定指標成分的含量評價石斛夜光丸的質量。

應用R語言軟件對所測定的結果進行分析。在選擇評價因素時，考慮到C企業樣品及E、F企業的部分樣品人參皂苷Rb1峰含量相對偏高，可能存在以西洋參代替人參投料而出現人參皂苷Rb1峰含量相對偏高的情況[11-16]，故本文采用新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1的含量及人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量的比值來作為評價人參質量的因素[17]。

2.7.1 主成分分析

應用R語言軟件以柚皮苷、新橙皮苷、人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量的比值為因素對所測結果進行主成分分析，用“summary”命令得到各主成分得分，見表3。第一主成分的貢獻率為73.20%，第二主成分的貢獻率為23.94%，累計達到97.14%，說明兩者能較全面地反映樣品間的差異。

表3 各主成分得分表

使用“tpc”及“cbind”計算各廠家綜合得分以及排名，見表4，可以清晰準確比較各廠家產品的質量情況。從表4可以看出，A廠得分最高，排第一。

表4 各廠家綜合得分以及排名

2.7.2 聚類分析

使用“biplot”與“plot”命令得到第一、第二主成分相關趨勢圖與聚類圖，見圖1、圖2，各生產企業大致分為4類：（1）H、G、I未檢出柚皮苷與新橙皮苷歸為一類；（2）C、F因人參皂苷Rg1與人參皂苷Re比值較低歸為一類；（3）A因人參皂苷Rg1含量以及其余與人參皂苷Re含量的比值較高歸為一類；（4）其余D、B、E歸為一類。

圖2 聚類圖

3 討論

3.1 檢測器的選擇

實驗過程中，考察了以乙腈-0.1%磷酸為流動相，使用紫外檢測器以203、283 nm為檢測波長對樣品中新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1進行測定，但因干擾峰較多，使供試品溶液制備過程更加繁瑣，且不同廠家產品有所差異，在測定過程中，無法保證待測組分與干擾峰均能得到有效分離。而采用HPLC-ELSD方法測定新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量，與紫外檢測器相比，干擾較少，使提取更簡單，結果更準確。

筆者曾采用Alltech 3300 ELSD低溫型蒸發光散射檢測器進行檢測，結果靈敏度欠佳。AllChrom ELSD6000高溫型蒸發光散射檢測器，指標性成分穩定性好，靈敏度高。

3.2 關于測定結果分析

采用建立的方法對9個生產企業57批石斛夜光丸進行檢測，并采用R語言和聚類分析方法對檢測結果進行分析，發現部分批次樣品未檢出新橙皮苷、柚皮苷峰，提示部分生產企業未按處方投料。57批石斛夜光丸柚皮苷、新橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re與人參皂苷Rb1含量存在差異，表明各生產企業之間5種成分均有顯著性差異，各企業對原藥材質量控制松緊不一，石斛夜光丸質量好壞參差不齊。

4 結論

本文采用HPLC-ELSD方法測定新橙皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量，五種成分精密度RSD為1.26%～2.95%，重復性RSD為0.62%～2.46%，24小時穩定性RSD為1.26%～2.92%。所建立的方法操作簡單易行，實驗結果穩定可靠，專屬性和重現性好。為石斛夜光丸中人參與麩炒枳殼的質量控制提供了有效的技術手段。

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Determination of 5 Components in Shihu Yeguang Pills by High Performance Liquid Chromatography with Evaporation Photodetector

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1and the content of new hesperidin and naringin in fructori aurantii. Methods: High performance liquid chromatography evaporative light scattering (HPLC-ELSD) was used. The mobile phase was acetonitrile water gradient elution, with an air flow rate of 2.0 L/min and a drift tube temperature of 110 ℃. The established method was used to measure the samples, and the results were analyzed using R language. Results: The 5 components tested showed good linear relationships within their respective linear ranges, with correlation coefficients r greater than 0.9996. The RSD for precision, repeatability, and stability were all less than 2.95%, with an average recovery rate of 96.7% to 99.5% and RSD less than 1.90%. Using R language to analyze the results, it was found that there were significant differences in the content of the 5 components of Shihu Yeguang pills from different manufacturers. Conclusion: This method is simple, fast, stable, and the determination results are accurate and reliable. It not only achieves the quality evaluation of fructori aurantii and ginseng in Shihu Yeguang pills, but also lays the foundation for further improving the overall quality control level of Shihu Yeguang pills. On the other hand, it also provides reference for the quality comparison research of Shihu Yeguang pills from different manufacturers.

Shihu Yeguang pills; fructori aurantii; ginseng; R language; HPLC-ELSD

O657

A

1008-1151(2023)09-0017-05

2023-02-27

李麗莉（1980－），女，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所副主任藥師，從事中藥民族藥質量控制研究工作。

呂軼峰（1982－），男，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所副主任藥師，從事中藥民族藥質量標準研究工作。