三七總皂苷治療血管內皮損傷性血栓功效評價研究

嚴燦梅 呂林艷 梁云飛 蘭 星 黃宇聲 鄭志遠　

三七總皂苷治療血管內皮損傷性血栓功效評價研究

嚴燦梅1,2呂林艷1,2梁云飛1,2蘭 星1,2黃宇聲1,2鄭志遠1,2

（1.廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西三七綜合利用技術重點實驗室，廣西 梧州 543000）

目的：利用斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型評價三七總皂苷對血管內皮損傷性血栓功效。方法：普納替尼建立斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型，三七總皂苷在28℃處理條件下18 h后測定MTD、心臟紅細胞染色強度及血流速度。結果：三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4對模型斑馬魚的MTD均為250 ng/尾，三七總皂苷樣品2對模型斑馬魚的MTD為62.5 ng/尾。三七總皂苷樣品均可增加模型斑馬魚心臟紅細胞染色強度、血流速度。結論：三七總皂苷具有改善斑馬魚血管內皮損傷性血栓功效。

三七總皂苷；血管內皮損傷；血栓；功效

引言

三七總皂苷（Panax notoginsenosides，PNS），是三七的主要活性成分，單體主要包括人參皂苷Ra、Rb1、Rc、Rg1、Rd、Re等，其他成分為多糖、蛋白質、微量元素等，在活血化瘀、改善微循環、通脈活絡等方面有較好活性，被廣泛用于治療心腦血管等疾病。目前，利用斑馬魚模型研究三七總皂苷的活血化瘀作用文獻報道較少。本文通過研究不同比例三七總皂苷對血管內皮損傷性血栓模型斑馬魚的作用，探討不同比例三七總皂苷活血化瘀作用，為提高三七總皂苷有效成份含量提供依據。

1 試驗材料

1.1 試驗樣品

三七總皂苷樣品1（皂苷含量為Rg1＞R1＞Rb1＞Re＞Rd）、三七總皂苷樣品2（皂苷含量為Rg1＞Rb1＞R1＞Re＞Rd）、三七總皂苷樣品3（皂苷含量為Rb1＞Rg1＞R1＞Rd＞Re）和三七總皂苷樣品4（皂苷含量為Rb1＞Rg1＞Rd＞R1＞Re），來源于廣西梧州制藥（集團）股份有限公司。各樣品用氯化鈉注射液配制成100 mg/mL母液，在-20℃環境下分裝儲存。

1.2 試驗動物

受精后5天（5 dPf）黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，用于樣品治療血管內皮損傷性血栓功效最大檢測劑量（MTD）測定及其功效評價。

斑馬魚飼養條件為水溫28℃，水質：200 mg速溶海鹽/1L純化水，pH調至6.5～8.5，電導率為450～550 μS/cm，硬度為50～100 mg/L CaCO3。斑馬魚均由杭州環特生物科技股份有限公司飼養，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2022-0004，飼養管理符合國際實驗動物評估和認可管理委員會（AAALAC）認證（認證編號001458）的要求。

1.3 儀器與試劑

儀器：顯微鏡（日本OLYMPUS，SZX7）；顯微注射儀（日本Narishige，IM300）；CCD相機（上海土森視覺科技有限公司，VerA1）；拉針儀（日本Narishige，PC-10）；心跳血流分析系統（法國ViewPoint Life Sciences，ZebraBlood3.4）；精密電子天平（美國OHAUS，CP214）。

試劑：氯化鈉注射液（批號S21091609，湖南科倫制藥有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號BCCD8942，Sigma公司）；甲基纖維素（批號C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；普納替尼（批號13771，美國MedChemExPress公司）；鄰聯茴香胺（批號MKBX3619V，Sigma公司）。

2 試驗方法

2.1 MTD測定

隨機選取5 dPf斑馬魚于6孔板中，每孔30尾。分別靜脈注射給予三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4（劑量見表1），同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。除正常對照組外，其余各組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型，在28℃條件下處理18 h后，測定樣品對模型斑馬魚的MTD。

2.2 治療血管內皮損傷性血栓功效評價

于6孔板中，每孔隨機處理斑馬魚30尾，以靜脈注射的給藥方式分別給予三七總皂苷樣品1組、三七總皂苷樣品2組、三七總皂苷樣品3組和三七總皂苷樣品4（劑量見表2），設正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。模型對照組及三七總皂苷各樣品組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型，28℃條件下處理18 h后，鄰聯茴香胺染色，每組隨機挑選10尾斑馬魚于解剖顯微鏡下觀察，收集數據，統計分析斑馬魚心臟紅細胞染色強度，以此指標評價三七總皂苷樣品治療血管內皮損傷性血栓功效。數據采用SPSS26.0軟件進行統計分析，＜0.05時為差異有統計學意義。

2.3 血管內皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價

隨機選取斑馬魚于6孔板中，每孔30尾，設正常對照組、模型對照組、三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4組，每孔容量為3 mL，各給藥組以靜脈注射方式分別給予相應的三七總皂苷樣品。除正常對照組外，其余各組均水溶給予普納替尼建立斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型，在28℃條件下處理18h后，每組隨機選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統下錄制斑馬魚血流視頻，分析統計斑馬魚血流速度，評價不同成分配比的三七總皂苷樣品對血流動力學改善功效。結果用SPSS26.0軟件進行統計學分析，＜0.05表明差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 MTD

在本實驗條件下，三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4對模型斑馬魚的MTD均為250 ng/尾，三七總皂苷樣品2對模型斑馬魚的MTD為62.5 ng/尾。詳見表1。

表1 樣品治療血管內皮損傷性血栓功效劑量摸索實驗結果（n＝30）

3.2 治療血管內皮損傷性血栓功效評價

在本次實驗條件下，與正常對照組比較，納普替尼處理18 h后模型對照組心臟紅細胞染色強度明顯降低（＜0.001），表明血管內皮損傷性血栓模型建立成功。與模型對照組比較，三七總皂苷樣品1在62.5、125及250 ng/尾濃度下均可顯著增加斑馬魚心臟紅細胞染色強度，具有統計學差異（＜0.05，＜0.001，＜0.001）；三七總皂苷樣品2的62.5 ng/尾濃度組可增加心臟紅細胞染色強度，具有統計學差異（＜0.001）；三七總皂苷樣品3的62.5、125和250 ng/尾濃度組均可增加心臟紅細胞染色強度，具有統計學差異（＜0.05，＜0.05，＜0.001）；三七總皂苷樣品4的62.5、125、250 ng/尾濃度組均可增加心臟紅細胞染色強度，具有統計學差異（＜0.05，＜0.01，＜0.01）。詳見表2、圖1和圖2。

表2 樣品治療血管內皮損傷性血栓功效評價實驗結果（n＝10）

注與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

圖1 斑馬魚心臟紅細胞染色強度典型圖

注：藍色虛線框處為分析部位斑馬魚心臟。

圖2 斑馬魚心臟紅細胞染色強度

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.3 血管內皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價

在本次實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組在造模18 h后血流速度明顯下降（＜0.001），表明模型建立成功。與模型對照組比，三七總皂苷樣品1于125 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品2于62.5 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品3于125 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05），三七總皂苷樣品4于 250 ng/尾濃度下血流速度顯著增加（＜0.05）。詳見表3和圖3。

表3 樣品血管內皮損傷性血栓血流動力學改善功效評價實驗結果（n＝10）

注與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05。

圖3 樣品處理后斑馬魚血流速度

注：與正常對照組比，###＜0.001；與模型對照組比，*＜0.05。

4 討論

血管內皮細胞是一種單層扁平細胞，介于血流與血管壁組織之間，是血管平滑肌和血液的屏障，可合成和釋放血管活性物質，調控血管張力，維持血管結構，在血流動力學與血管的收縮舒張功能方面具有不可替代的調控作用，對維持正常的血液循環有重要的生理作用[1]。大量研究數據顯示，血管內皮細胞發生損傷及其導致的病理變化是形成血瘀證的重要因由，與多種心血管疾病危險因素有著密切的聯系[2]。

斑馬魚能夠全面、方便、快捷地檢測評估先導藥物的初步藥效和安全性，進而實現藥物的高通量篩選，是目前生命科學研究中最佳模式生物之一[3]。普納替尼是一種激酶抑制劑，可阻斷血管內皮生長因子（VEGF）與其受體的作用，從而干擾血管內皮細胞遷移、存活等正常生理功能而誘發血管內皮發生損傷，導致血管產生堵塞，引起血栓[4]。在斑馬魚軀干出現血栓之后，回心血量隨之減少，減小血管直徑，降低血流速度，通過血紅細胞特異性染色（呈紅色），利用斑馬魚血液系統呈透明的獨特優勢[5,6]，可在顯微鏡下直接觀察心臟紅細胞，血管內皮損傷性血栓模型斑馬魚心臟紅細胞數量明顯少于正常斑馬魚心臟紅細胞數量，通過心跳血流分析系統可直接觀察采集斑馬魚血流相關數據。

5 結束語

本研究采用普納替尼致斑馬魚血管內皮損傷性血栓模型，探討不同配比三七總皂苷改善血管內皮損傷性血栓功效。研究結果表明，三七總皂苷樣品1、三七總皂苷樣品2、三七總皂苷樣品3和三七總皂苷樣品4均可增加血管內皮損傷性血栓模型斑馬魚心臟紅細胞數量和提高血流速度，改善斑馬魚血管內皮損傷性血栓，從而發揮活血化瘀的功效。其中在62.5 ng/尾濃度下，三七總皂苷樣品2增加斑馬魚心臟紅細胞數量和提高血流速度最佳。

[1] 胡小勤. 血瘀證與血管內皮細胞損傷研究進展[J]. 中華中醫藥雜志，2012，27(1): 153-155.

[2] 胡聿昕，廖俊雅，張志清，等. 血流剪應力對血管內皮細胞的影響及其與血瘀證的關系[J]. 中華中醫藥雜志，2022，37(7): 3995-3998.

[3] 秦小妹，郭帥杰，李悅，等. 斑馬魚模型在中藥心血管藥理學研究中的應用[J]. 世界中醫藥，2021，16(15): 2358-2361.

[4] 張亞楠，孫繼紅，黃新益，等. 普納替尼對人血管內皮細胞功能的影響[J]. 藥物評價研究，2015，38(2): 156-160.

[5] 陳維武，白瑪卓瑪，郭勝亞，等. 二十五味珍珠片對斑馬魚微血管功能的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2019(13): 49-54.

[6] 王木蘭，潘永明，金敏，等. 斑馬魚血栓模型的建立與冠心寧片的干預作用[J]. 中國實驗動物學報，2016，24(4): 432-438.

Study on the Evaluation of the Efficacy of Panax Notoginsenosides in the Treatment of Vascular Endothelial Injury Thrombosis

Objective: To evaluate the effect of Panax notoginsenosides on vascular endothelial injury thrombosis by using the Zebrafish vascular endothelial injury thrombosis model. Methods: Ponatinib was used to establish Zebrafish vascular endothelial injury thrombus model. After being treated with Panax notoginsenosides at the condition of 28℃ for 18 hours, MTD, red blood cell staining intensity and blood flow velocity were measured. Results: The MTD of Panax notoginsenosides sample 1, Panax notoginsenosides sample 3 and Panax notoginsenosides sample 4 to model Zebrafish was 250 ng/tail, and the MTD of Panax notoginsenosides sample 2 to model Zebrafish was 62.5 ng/tail. Panax notoginsenosides can increase the red blood cell staining intensity and blood flow velocity of model Zebrafish heart. Conclusion: The Panax notoginsenosides can improve the thrombotic effect of Zebrafish vascular endothelial injury.

Panax notoginsenosides; vascular endothelial injury; thrombus; efficacy

R743; R285

A

1008-1151(2023)09-0070-04

2023-04-12

中央引導地方科技發展資金項目（桂科ZY22096004）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD20297068）；梧州市科技計劃項目（202202009）。

嚴燦梅（1990－），女，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司實驗師，從事藥理研究相關工作。

鄭志遠（1967－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司高級工程師，從事藥物研究相關工作。