糖異平對糖耐量減低合并非酒精性脂肪肝大鼠氧化應激及炎癥因子表達的影響

王玉玲 倪琳琳 趙良倩

1.山東省臨沂市中醫醫院婦科，山東臨沂 276002；2.山東中醫藥大學第二附屬醫院生殖科，山東濟南 250014

隨著人們生活水平的提高，代謝相關疾病發病率不斷增加，糖耐量減低（impaired glucose tolerance，IGT）和非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病率也在日益增長，有數據顯示目前全球NAFLD發病率為25.24%，亞洲為27.37%[1]，糖尿病人群中NAFLD的患病率為76%[2]。IGT作為糖尿病的前期階段也是NAFLD的高危因素。有研究表明人群由IGT向2型糖尿病進展過程中脂肪肝的患病率也逐漸升高，并且程度逐漸加重[3]。在IGT合并NAFLD階段及時干預可以降低糖尿病發病風險及NAFLD進一步向肝纖維化發展。目前大部分觀點認為NAFLD發病[4]：一是胰島素抵抗會導致肝脂肪的變性；二是氧化應激反應引起肝細胞產生脂質過氧化及激活炎性細胞因子導致脂肪性的肝炎。炎癥反應是NAFLD發展中非常重要的一環[5]。脂質肝臟異常堆積使肝臟的脂質過氧化和氧化應激，導致細胞死亡激活內皮細胞使細胞因子表達增加，促進炎癥反應和肝臟纖維化，促進了NAFLD的進展[6]。本研究通過觀察糖異平對IGT合并NAFLD模型大鼠糖脂代謝及炎癥因子和氧化應激水平的影響，探討糖異平治療IGT合并NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性Wistar大鼠40只，許可證號SYXK（魯）2022 0009，體重150～180 g，由山東大學實驗動物中心提供。本研究經臨沂市中醫醫院醫學倫理委員會審批。白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測試劑盒（美國ADL公司）。大鼠灌胃器、手術器械、5 ml與l ml注射器、ELx800酶標儀、BP310S電子天平、WKYin微量移液器、高速低溫離心機3K-30、超低溫冰箱725、強生ONETOUCHHorizon型血糖儀、OLYMPUS AU2700全自動血生化儀（日本OLYMPUS公司）。高糖高脂飼料（10.0%豬油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和59.5%常規飼料）定購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。糖異平（生黃芪30 g、玄參15 g、柴胡9 g、黃連9 g、白芍15 g、蒼術12 g、川牛膝12 g、丹參15 g）。所用藥物購于山東中醫藥大學附屬醫院，所有中藥冷水泡30 min，兩煎相兌后濃縮至1 g/ml（生藥量）。

1.2 動物造模及給藥

1.2.1 動物分組喂養 Wistar大鼠40只，雌雄分別20只，喂養7 d后，將大鼠隨機分為對照組（n=10）及實驗組（n=30）。其中對照組給予常規飼料喂養，實驗組予高糖高脂飼料喂養。喂養期大鼠都自由喝水，每只大鼠均每天早晚分別喂養1次，每天所喂食量均為其體重的3%。

1.2.2 IGT合并NAFLD大鼠模型建立 大鼠共被喂養8周，并被禁食12 h后，自鼠尾采血測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；再依據大鼠體重（2 g/kg）分別給予50%濃度的高濃度葡萄糖注射液灌胃，2 h后再次自鼠尾采血測餐后2 h血糖（2 h postprandial blood glucose，2 hPG）。FPG＜7 mmol/L且7.8 mmol/L≤2 hPG＜11.1 mmol/L表示IGT大鼠造模成功；實驗組則按照隨機原則選取2只大鼠處死，并分別取大鼠肝臟常規病理切片后再行HE染色，光鏡下若發現空泡樣變性的肝細胞表示NAFLD大鼠造模成功，將IGT合并NAFLD建模[7]成功大鼠納入本研究。

1.2.3 實驗分組及給藥劑量 選取實驗組中20只造膜成功的大鼠，隨機分為模型組和治療組，每組各10只。模型組與治療組均予以高糖、高脂飲食，對照組予以常規飲食。給藥量按照“人和動物體表面積折算的等效劑量”計算而得，治療組予以中藥水煎劑12.19 g/（kg·d）灌胃，每天1次；模型組和對照組均給予等量生理鹽水灌胃。干預4周。

1.3 標本采集

末次給藥后禁食不禁水18 h，麻醉后腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清。

1.4 指標檢測

①一般情況：分別觀察大鼠的精神狀態、活動情況、食欲、毛色及大小便等情況。②血糖（FPG、2 hPG）水平：大鼠禁食12 h后，經鼠尾采血測血糖（FPG、2 hPG）水平。③血脂水平：用全自動生化分析儀檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）及 高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）的 水 平。④炎 癥 因 子：IL-6、TNF-α及IL-1β水平依照試劑盒操作書步驟進行檢測。⑤氧化應激指標：丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平依照試劑盒操作書步驟進行檢測。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察

對照組大鼠正常喂養，皮毛光澤鮮亮，反應機敏；模型組大鼠高糖高脂飲食，精神不振，反應遲滯，皮毛雜亂稀少，體重明顯增加；治療組大鼠較模型組癥狀輕，精神狀態一般，反應較模型組大鼠靈敏，皮毛柔順。觀察期間無大鼠死亡。

2.2 各組大鼠治療前后FBG、2 hPG水平比較

治療前，與對照組比較，模型組FBG（t=1.427，P=0.035）、2 hPG（t=3.638，P=0.028）和治療組FBG（t=1.326，P=0.046）、2 hPG（t=4.783，P=0.038）水平均較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；同模型組比 較，治 療 組FBG（t=-1.578，P=0.225）、2 hPG（t=-3.108，P=0.135）水平均較低，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

表1 各組大鼠治療前FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

注 與對照組比較，aP ＜ 0.05；FBG：空腹血糖；2 hPG：餐后2 h血糖

組別 n FBG 2 hPG對照組 10 4.26±0.32 6.64±0.45模型組 10 4.43±0.14a 9.15±0.61a治療組 10 4.42±0.64a 8.91±0.97a

各組大鼠在藥物干預4周后，與對照組比較，模 型 組FBG（t=2.213，P=0.032）、2 hPG（t=2.940，P=0.023）和治療組FBG（t=1.727，P=0.002）、2 hPG（t=2.681，P=0.038）水平均升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），提示大鼠存在糖代謝紊亂；同模型組比較，治療組FBG（t= -1.928，P=0.002）、2 hPG（t=-2.263，P=0.000），差異有統計學意義（P＜ 0.05），表示糖異平可以有效改善模型大鼠的血糖，糾正代謝紊亂。見表2。

表2 各組大鼠治療后FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

表2 各組大鼠治療后FBG、2 hBG比較（mmol/L， ± s）

注 與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；FBG：空腹血糖；2 hPG：餐后2 h血糖

組別 n FBG 2 hPG對照組 10 4.08±0.52 6.64±0.45模型組 10 4.12±0.56a 8.90±0.65a治療組 10 4.11±0.39ab 7.10±0.68ab

2.3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較

各組大鼠在藥物干預4周后，與對照組比較，模型組大鼠TG（t=6.542，P=0.028）、TC（t=4.286，P=0.045）、LDL（t=1.010，P=0.042）水平均升高，差 異 有 統 計 學 意 義（P＜ 0.05）；HDL（t=-2.241，P=0.130）水平降低，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。與對照組比較，治療組大鼠TG（t=-7.917，P=0.009）、TC（t=-4.130，P=0.028）、LDL（t=-5.110，P=0.043）水平均降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；HDL（t=1.950，P=0.897）水平升高，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。與模型組比較，治療組大鼠TG（t=-4.501，P=0.016）、TC（t=-3.593，P=0.004）水平均降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；LDL（t=-4.236，P=0.523）水平降低，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；HDL（t=14.230，P=0.032）水平升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。提示糖異平能有效降低血脂。見表3。

表3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較（mmol/L， ± s）

表3 各組大鼠治療后TG、TC、LDL、HDL水平比較（mmol/L， ± s）

注 與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；TC：總膽固醇；TG；三酰甘油；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白

組別 n TG TC LDL HDL對照組 10 0.43±0.05 1.27±0.12 0.19±0.03 0.61±0.01模型組 10 0.65±0.04a 1.48±0.23a 0.23±0.02a 0.59±0.13治療組 10 0.41±0.05ab 1.24±0.16ab 0.16±0.01a 0.67±0.14b

2.4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較

各組大鼠在藥物干預4周后，與對照組比較，模型組大鼠的血清炎癥因子IL-6（t=0.238，P=0.026）、IL-1β（t=2.602，P=0.034）、TNF-α（t=0.890，P=0.023）和 治 療 組IL-6（t=0.669，P=0.041）、IL-1β（t=1.155，P=0.045）、TNF-α（t=0.176，P=0.039）水平均升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；同模型組比較，治療組大鼠血清炎癥因子IL-6（t=-2.027，P=0.012）、IL-1β（t=-1.791，P=0.048）、TNF-α（t=-0.922，P=0.026）水平均降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。提示糖異平方能使機體的炎癥反應有效降低。對照組 10 43.64±5.05 10.72±1.21 25.58±2.16模型組 10 95.21±9.05a24.62±1.24a79.23±5.02a治療組 10 54.06±4.78ab12.53±1.76ab37.76±3.36ab

表4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較（pg/ml， ± s）

表4 各組大鼠治療后血清炎癥因子比較（pg/ml， ± s）

組別 n IL-6 IL-1β TNF-α

2.5 各組大鼠氧化應激指標比較

各組大鼠在藥物干預4周后，與對照組比較，模型組大鼠氧化應激指標SOD（t=-1.103，P=0.046）、MDA（t=-1.024，P=0.031）、GSH（t=-2.901，P=0.034）和 治 療 組SOD（t=-1.719，P=0.045）、GSH（t=-3.962，P=0.042）水平均降低，MDA（t=-2.190，P=0.044）水平升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；同模型組比較，治療組氧化應激 指 標SOD（t=1.236，P=0.004）、GSH（t=1.045，P=0.008）水平均升高，MDA（t=3.854，P=0.030）水平降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表5。提示糖異平方能有效改善機體的氧化應激反應。

表5 各組大鼠治療后之氧化應激指標比較（mmol/ml， ± s）

表5 各組大鼠治療后之氧化應激指標比較（mmol/ml， ± s）

注 與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH：谷胱甘肽

組別 n SOD MDA GSH對照組 10 173.64±5.05 2.52±0.21 4.58±0.56模型組 10 155.21±9.05a 5.62±0.24a 2.23±0.32a治療組 10 170.06±4.78ab 3.23±0.76ab 3.89±0.56ab

2.6 大鼠肝臟組織病理情況

光鏡下可見對照組之大鼠肝組織細胞結構規則，肝索呈放射性分布，小葉邊界清晰，外觀肝細胞形態規則，細胞核明顯，可見胞質均勻，未見沉積的脂滴，未發現浸潤的炎性細胞。模型組的大鼠肝臟肝索排列不規則，肝細胞腫大，許多大小不等的脂肪空泡可見，邊界欠清晰，可見浸潤的炎性細胞。糖異平治療組的大鼠肝細胞鏡下見相對規整，排列尚規則，細胞內少量脂肪空泡可見，未看見壞死的肝細胞。提示糖異平能有效降低脂質在肝臟的堆積，并能使炎癥反應減輕，減輕肝臟脂肪變性，對IGT合并NAFLD的肝臟起到良好的保護。見圖1。

圖1 大鼠肝臟組織病理情況（HE染色，40×）

3 討論

IGT指空腹血糖正常但餐后血糖水平介于正常血糖水平和糖尿病血糖水平之間的一種特殊類型代謝狀態。IGT患者是目前重要的糖尿病高危人群，每年有大量IGT患者進展為糖尿病。據報告，我國每年有1.5%～10%的IGT患者進展為2型糖尿病[8]。IGT患者中NAFLD發病率高于普通人群，IGT患者高血糖導致體內糖分解受阻，脂肪組織代謝增強，使得血漿內游離脂肪酸水平明顯升高，游離脂肪酸可通過增加胰島素分泌來誘胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。NAFLD發病機制目前尚無明確定論，現被廣泛認為的是經典（二次打擊）學說[9]，認為“第一次打擊”是因為胰島素抵抗引起肝細胞內的TG合成與轉運出現紊亂而導致脂質沉積，引起單純的脂肪變性；“第二次打擊”是在“第一次打擊”后，肝細胞受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的誘導產生氧化應激反應、炎癥反應甚至壞死，繼而引起肝硬化的發生和發展，炎癥因子在NAFLD的發生、發展中起到重要的作用[10]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為一種誘導性核轉錄因子，當受到外界刺激時可被激活，進入細胞核參與炎癥反應[11]。NF-κB活化后，可增加炎癥因子IL-6、TNF-α的產生和釋放，進而再次激活NF-κB，從而導致最初的炎癥信號進一步放大[12]。MDA是細胞氧化代謝產物，其可反映機體的脂質過氧化物破壞程度，SOD、GSH兩者均為重要的內源性的氧自由基清除劑，可對抗氧自由基，從而防止其對機體組織細胞的破壞[13-14]。現代醫學對IGT合并NAFLD的治療目前主要是通過生活方式控制、改善胰島素抵抗及應用降脂藥物等對癥處理為主。IGT合并NAFLD作為一個病程中的可逆階段積極治療預后良好，如果疏于管理則可能進一步發展為糖尿病或肝硬化。中藥治療IGT合并NAFLD經臨床觀察效果滿意且安全無副作用。糖異平前期臨床研究表明可有效降低IGT患者餐后血糖，改善臨床癥狀，降低炎癥因子，治療IGT安全有效[15]。本研究通過高脂高糖飼料造成大鼠IGT合并NAFLD模型，糖異平灌胃4周后觀察糖異平對IGT合并NAFLD大鼠糖脂代謝及炎癥因子的影響。結果顯示與模型組相比糖異平組2 hPG降低，糖異平組TG、TC與模型組比較明顯降低，HDL明顯升高，LDL有降低趨勢但差異無統計學意義。造模后模型動物血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量均高于對照組。治療組IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均低于模型組。提示糖方平可有效抑制IGT合并NAFLD大鼠模型的炎癥反應。提示糖異平通過對2型糖尿病并發NAFLD具有降低血糖血脂的作用，同時可以通過改善炎癥因子的表達以及改善氧化應激狀態來起到對IGT合并NAFLD的治療作用。