乳酸誘導巨噬細胞M2型極化對黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

楊穎穎，邱煒

作者單位：1貴州醫科大學生物與工程學院，貴州 貴陽550000；2遵義市第一人民醫院腫瘤科，貴州 遵義563000

惡性黑色素瘤是最具侵襲性和抗治療性的皮膚癌形式，其侵襲性主要是基于黑色素瘤細胞的高度轉移潛力［1］。盡管靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療取得了一定的療效，但轉移性黑色素瘤仍然是一種無法治愈的疾病［2-3］。因此，探索黑色素瘤轉移的機制對于提高其診斷和治療水平極為必要。

腫瘤轉移與腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）高度相關［4］。缺氧引發一系列生化反應引發局部酸化進而將TME轉變為對抗腫瘤免疫細胞不利環境的驅動力之一［5］。乳酸（lactic acid，LA）是一種信號分子，在調節TME內的代謝途徑、免疫反應和細胞內通信等方面具有重要作用［6］。此外，乳酸在厭氧腫瘤環境中濃度很高，并且已被證明可以改變巨噬細胞以獲得促進腫瘤生長的特性［7］。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）參與調控惡性腫瘤發生和進展的穩態。此外，已有多項研究表明，在多種類型黑色素瘤中都觀察到少量巨噬細胞［8］。然而，TAM在黑色素瘤轉移中的功能仍然未知。本研究于2021年1月至2022年2月，首次描述了黑色素瘤的惡性生物學行為與乳酸誘導的TAM 極化之間的關系。

1 材料和方法

1.1 主要材料 乳酸（純度≥98%，L6402）、脂多糖（LPS）（來源于大腸桿菌0111：B4，L5293）、白細胞介素（IL）-4（純度≥98%，SRP3211）獲取自美國Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細胞Raw264.7（HTX1760）和小鼠黑色素瘤細胞系B16F10（AC-2661H）獲取自上海雅吉生物科技有限公司；CCK-8細胞增殖與毒性檢測試劑盒（CK04）獲取自上海研卉生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒獲取自臺灣亞諾法生技股份有限公司；小鼠IL-12 ELISA試劑盒（orb566228）、小鼠IL-10 ELISA試劑盒（orb565120）獲取自英國Biorbyt公司；CD206（ab270647）抗體獲取自英國Abcam公司；High Capacity cDNA反轉錄試劑盒（4368813）、Maxima SYBR Green qPCR（K0253）獲取自美國Thermofisher。

1.2 方法

1.2.1 實驗藥物配制 乳酸通過首先溶解在少量的DMSO溶液中，而后慢慢添加PBS緩沖液溶解進而配制形成1 mol/L的母液，保存于-4 ℃冰箱備用。待使用時使用相應的培養基配制為合適的濃度。

1.2.2 細胞培養 Raw264.7和B16F10細胞使用DEME培養基培養（含10%胎牛血清），常規傳代培養。實驗中使用的細胞傳代次數不超過30次。

1.2.3 乳酸的細胞毒性檢測 將培養的Raw264.7和B16F10細胞以1×104個/孔鋪至96孔板中繼續培養，待細胞貼壁生長后，添加不同濃度的乳酸（0、5、10、20 mmol/L）［9］繼續培養24 h。隨后，添加10 μL的CCK-8溶液培養4 h后，在酶標儀中檢測乳酸處理后的細胞活力。細胞活力（%）=（OD對照組-OD實驗組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.4 細胞分組 將Raw264.7細胞以1×106個/孔鋪至6孔板中，將其依次分為對照組、LPS組（誘導M1型巨噬細胞）、IL-4組（誘導M2型巨噬細胞）、乳酸 5 mmol/L組、乳酸 10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組。對照組Raw264.7細胞常規培養，LPS組Raw264.7細胞使用終濃度為1 mg/L的LPS［10］處理，IL-4組Raw264.7細胞使用終濃度為20 μg/L的IL-4［10］處理；乳酸 5 mmol/L組、乳酸 10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組分別使用終濃度為5、10、20 mmol/L的乳酸處理，所有細胞均培養24 h。

1.2.5 黑色素瘤細胞增殖實驗 收集各組處理的Raw264.7細胞的上清液用于培養B16F10細胞培養24 h。隨后，添加10 μL的CCK-8溶液培養4 h后，在酶標儀中檢測乳酸處理后的細胞活力。細胞活力（%）=（OD對照組-OD實驗組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.6 黑色素瘤細胞凋亡實驗 各組處理的Raw264.7細胞的上清液培養B16F10細胞24 h后，將細胞懸浮于200 μL的緩沖液中，分別添加10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI溶液避光孵育20 min，在1 h內通過流式細胞儀分析各組細胞凋亡率。

1.2.7 黑色素瘤細胞遷移實驗 B16F10細胞按照1×106個/孔鋪至6孔板中，待其鋪滿后，使用200 μL移液器槍頭進行劃痕，使用各組處理的Raw264.7細胞的上清液培養24 h，分別對0 h和24 h后的劃痕寬度進行拍照記錄。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8 黑色素瘤細胞侵襲實驗 50 μL的基質膠包被在Transwell小室（8 μm）上室中，將B16F10細胞使用無血清的DEME培養基稀釋后接種在Transwell小室上室中，下室中添加正常培養基。常規培養24 h后，使用4%多聚甲醛將小室下室中細胞固定并通過0.1%結晶紫染色20 min，在顯微鏡下對侵襲到下室中的細胞進行拍照并統計。

1.2.9 巨噬細胞形態觀測 培養Raw264.7細胞，按照“1.2.4”中方法分組處理后于光學顯微鏡下觀察各組Raw264.7細胞形態學變化。

1.2.10 巨噬細胞極化相關因子表達檢測 嚴格按照試劑盒說明，收集每組Raw264.7細胞上清液，每孔中添加50 μL的樣品，使用試劑盒中的膠帶覆蓋并孵育。加入對應的IL-12或IL-10結合物，再次孵育。加入底物避光孵育30 min后加入終止液終止反應。檢測各組細胞的吸光度，根據繪制的標準曲線得出各因子濃度。

1.2.11 qRT-PCR檢測腫瘤蛋白翻譯調節因子1（Tpt1）和肺腺癌轉移相關轉錄本1（Malat1）表達水平 Trizol試劑從各組處理的Raw264.7細胞中分離總RNA。使用反轉錄試劑盒制備cDNA。接下來使用SYBR Green（2×）和特異性引物（均由上海生工設計并合成）進行qRT-PCR分析，使用2-ΔΔCt方法計算倍數變化，然后進行統計分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.12 CD206表達水平檢測 Raw264.7細胞接種在6孔板中（1×106個/孔），按照1.2.4中方法分組處理后收集細胞，加入CD206抗體在室溫下避光孵育20 min，添加PBS清洗后，在流式細胞儀中檢測CD206表達水平。

1.3 統計學方法 SPSS 22.0對本文中的實驗數據進行分析。Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢測，符合正態分布的研究結果使用來表示。采用單因素方差分析進行多組間的比較，多組間比較具有差異的數據進一步兩兩比較通過SNK-q檢驗進行。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳酸對巨噬細胞和和黑色素瘤細胞活性的影響 不同濃度乳酸對Raw264.7細胞和B16F10細胞均無明顯細胞毒性（P＞0.05）。見表2。

表2 乳酸對Raw264.7細胞和B16F10細胞的毒性作用檢測/

表2 乳酸對Raw264.7細胞和B16F10細胞的毒性作用檢測/

乳酸0 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L F值P值重復次數3 3 3 3 Raw264.7 100.00±0.00 97.65±2.54 94.26±4.65 89.31±8.09 2.76 0.111 B16F10 100.00±0.00 95.65±2.62 92.10±5.17 86.31±8.46 3.82 0.057

2.2 乳酸調控巨噬細胞對黑色素瘤細胞惡性生物學行為的影響 如表3結果所示，使用不同濃度乳酸干預Raw264.7細胞后的上清液培養B16F10細胞，結果顯示，與對照組相比，乳酸組和IL-4組細胞活力、劃痕愈合率以及侵襲細胞數量均明顯升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），LPS組細胞活力、劃痕愈合率、侵襲細胞數量以及凋亡率均無顯著變化（P＞0.05）。而不同濃度乳酸組隨著乳酸濃度升高，細胞活力、劃痕愈合率以及侵襲細胞數量逐漸升高，細胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05）。由此推測，乳酸可能誘導巨噬細胞M2型極化促進黑色素瘤惡性生物學行為。

表3 乳酸對B16F10細胞惡性生物學行為的影響/

注：LPS為脂多糖，IL為白細胞介素。①與對照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸10 mmol/L組比較，P＜0.05。

侵襲細胞數/個45.36±4.21 50.13±5.23 167.26±12.36①②89.36±8.12①②③113.05±10.03①②③④131.25±11.14①②③④⑤126.32＜0.001組別對照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復次數3 3 3 3 3 3細胞活力/%100.00±0.00 92.23±8.76 188.37±9.25①②125.36±7.88①②③144.36±8.65①②③④167.28±10.12①②③④⑤63.78＜0.001凋亡率/%57.26±4.25 55.14±3.45 8.20±0.87①②41.23±4.02①②③29.26±3.14①②③④18.64±2.09①②③④⑤115.39＜0.001劃痕愈合率/%25.26±2.23 28.23±2.02 78.26±6.25①②39.21±3.15①②③52.65±3.87①②③④64.24±6.12①②③④⑤71.25＜0.001

2.3 乳酸誘導巨噬細胞Raw264.7向M2型極化設置LPS誘導的M1型巨噬細胞和IL-4誘導的M2型巨噬細胞為對照，使用上述驗證的無毒性的乳酸處理巨噬細胞24 h。觀察細胞形態得出，乳酸組巨噬細胞形態學變化與IL-4組相似，均呈現M2樣變化。進一步結果顯示（表4），與對照組比較，LPS組細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-12均升高（P＜0.05），血管內皮生長因子（VEGF）、IL-10、CD163水平無顯著變化（P＞0.05）；IL-4組和乳酸 5 mmol/L組、乳酸10 mmol/L組和乳酸 20 mmol/L組細胞中TNF-α、IL-12水平差異無統計學意義，VEGF、IL-10、CD163水平顯著升高（P＜0.05）。ELISA實驗檢測的IL-12與IL-10表達水平以及流式細胞儀檢測的CD206的表達水平則具有相似的結果（P＜0.05）。經過對巨噬細胞的形態學觀察和相關分子水平的檢測得出，乳酸可誘導巨噬細胞向M2型極化。

表4 qRT-PCR檢測乳酸對B16F10細胞M1和M2極化相關分子水平比較/

表4 qRT-PCR檢測乳酸對B16F10細胞M1和M2極化相關分子水平比較/

注：LPS為脂多糖，IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，VEGF為血管內皮生長因子。①與對照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸 5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸 10 mmol/L組比較，P＜0.05。

CD163/%8.15±0.78 8.87±0.64 58.36±5.12①②18.39±1.54①②③25.69±2.87①②③④37.16±3.15①②③④⑤138.81＜0.001組別對照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復次數3 3 3 3 3 3 TNF-α/（ng/L）22.39±3.36 45.63±4.58①23.15±1.37 22.36±2.15 24.36±2.02 20.19±2.18 34.45＜0.001 IL-12/（ng/L）45.17±4.16 87.29±7.15①40.13±5.01 41.39±4.27 44.26±4.13 48.26±3.15 41.89＜0.001 VEGF/（ng/L）78.15±7.56 82.56±8.36 245.36±20.15①②124.36±11.03①②③164.39±14.35①②③④198.65±15.39①②③④⑤72.89＜0.001 IL-10/（ng/L）27.25±2.21 32.36±3.14 97.54±7.25①②47.26±4.02①②③65.32±5.48①②③④79.36±7.12①②③④⑤83.13＜0.001

2.4 乳酸對巨噬細胞中Tpt1、Malat1表達的影響表5結果顯示，與對照組比較，不同濃度乳酸可明顯提高Tpt1 mRNA和Malat1 mRNA表達水平（P＜0.05），結果與IL-4組相一致，而LPS組Tpt1 mRNA和Malat1 mRNA表達水平無明顯變化。

表5 乳酸對Raw264.7細胞中Tpt1、Malat1表達水平的影響/

表5 乳酸對Raw264.7細胞中Tpt1、Malat1表達水平的影響/

注：LPS為脂多糖，IL-4為白細胞介素-4，Tpt1為腫瘤蛋白翻譯調節因子1，Malat1為肺腺癌轉移相關轉錄本1。①與對照組比較，P＜0.05。②與LPS組比較，P＜0.05。③與IL-4組比較，P＜0.05。④與乳酸 5 mmol/L組比較，P＜0.05。⑤與乳酸 10 mmol/L組比較，P＜0.05。

Malat1 1.08±0.06 1.03±0.03 2.95±0.20①②1.52±0.14①②③1.94±0.13①②③④2.56±0.17①②③④⑤101.43＜0.001組別對照組LPS IL-4乳酸 5 mmol/L乳酸 10 mmol/L乳酸 20 mmol/L F值P值重復次數3 3 3 3 3 3 Tpt1 1.02±0.05 1.05±0.04 3.15±0.21①②1.57±0.12①②③1.97±0.17①②③④2.60±0.21①②③④⑤97.25＜0.001

3 討論

以往研究大多都集中在基因組本身與腫瘤本身，以說明腫瘤惡性行為的機制。腫瘤細胞與基質細胞之間的相互調節塑造了TME的狀態，這可能決定腫瘤的結果，并且可能是腫瘤發展的一種新機制［11］。乳酸已被證明可以改變多個關鍵癌基因的轉錄活性，并且研究證實乳酸產生誘發的致癌信號可以作為Warburg效應的一個重要目的［12］。乳酸代謝不僅與缺氧（產生乳酸）和常氧（輸入乳酸）癌細胞之間的代謝平衡相關，而且還與缺氧癌細胞將TAM極化為糖酵解不良的M2型巨噬細胞有關［13］。據報道，癌細胞中糖酵解增加引起的而TME的酸化，而黑色素瘤則通過感知TME的酸化來促進TAM的M2型極化［14］。已證明，乳酸特別地將TAM偏向于“腫瘤友好”的M2樣表型進而幫助腫瘤細胞逃避免疫監視［15］。本研究發現，乳酸對巨噬細胞Raw264.7和黑色素瘤細胞B16F10均無明顯毒性，但乳酸作用Raw264.7細胞后的上清液可明顯促進B16F10細胞的惡性生物學行為。提示乳酸可能通過調控TAM，進而對黑色素瘤具有促癌作用。

TAM是組織和TME內穩態的關鍵調節劑。原發性腫瘤中的TAM促進腫瘤的遷移和侵襲，被認為是癌癥聯合治療中極具吸引力的一部分［16］。既往研究表明，腫瘤組織中巨噬細胞常為M2型，往往具有促進腫瘤增殖和轉移的作用［17］。另外，研究證實，在小鼠模型體內調節巨噬細胞向M1型激活可有效抑制黑色素瘤細胞轉移［18］。本研究結果發現，乳酸干預Raw264.7細胞后，Raw264.7細胞呈現M2型變化，且可明顯提高M2型巨噬細胞極化相關分子VEGF、CD163和IL-10的表達，而對M1型巨噬細胞極化相關分子IL-12和TNF-α的表達無顯著影響。以上數據表明，乳酸可促進巨噬細胞M2型極化。然而，對于乳酸誘導巨噬細胞M2型極化后如何調控黑色素瘤的發展尚不清楚。因此，有必要對巨噬細胞M2型極化的關鍵分子靶點進行探究。Tpt1是一種高度保守的蛋白質，據報道它在多種惡性腫瘤中強烈表達，參與調控細胞增殖、侵襲、細胞周期和細胞凋亡等過程［19］。Wang等［20］研究發現，Tpt1在胃癌組織和細胞中高表達，抑制Tpt1可顯著抑制胃癌細胞增殖和遷移。另外，Malat1是長鏈非編碼RNA中的一種，首次在肺癌中發現，在多種癌癥中均具有預后和診斷價值［21］。已有多項研究表明，Malat1在黑色素瘤中發揮促癌作用，下調Malat1可通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲進而抑制黑色素瘤的發展［22］。且研究表明，細胞外囊泡穿梭的Malat1可促進巨噬細胞極化［23］。令人感興趣的是，本研究發現，乳酸作用Raw264.7細胞可明顯提高Tpt1和Malat1的表達水平，提示Tpt1和Malat1極有可能是乳酸誘導巨噬細胞M2極化的分子靶點，暗示乳酸可能通過上調Tpt1和Malat1表達進而誘導巨噬細胞M2極化，在黑色素瘤中發揮促癌作用。然而，其中的具體作用機制仍需進一步探究。

綜上，乳酸誘導的TAM M2型極化可促進黑色素瘤的發展。這一發現為黑色素瘤的免疫治療提供新的參考依據。然而，本研究并未對乳酸是否以及如何通過TAM極化影響黑色素瘤細胞活性進行初步驗證，而是直接進行了TAM M2型極化分析，缺乏中間的過度實驗。其次，本研究并未在動物模型中進行同步驗證。后續仍需進一步探索以補充完善乳酸在黑色素瘤發展過程中作用機制。