長鏈非編碼RNA OTUD6B-AS1、微RNA-365a-3p在肝癌中表達與臨床病理特征及預后的關系

宋奇鋒，高良輝，林師佈，張譯中，沈立

作者單位：海南醫學院第一附屬醫院肝膽外科，海南 海口570100

肝癌是在全球范圍內最常見的致命惡性腫瘤，而在所有的肝癌病人中，超過90%為肝細胞癌［1］。盡管近年來由于治療方法的改進有效地降低了肝癌的發病率，但肝癌病人的長期預后仍不理想［2］。因此，探索有效的生物標志物對于改善肝癌的預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNA）位于細胞核或細胞質中，長度超過200個核苷酸。雖然LncRNA不具備蛋白質編碼能力，但它們在表觀遺傳學和調節基因表達方面具有重要作用［3］。已證實LncRNA參與腦發育、胚胎發育、組織學分化和器官發生，且已有大量研究表明LncRNA還參與了癌癥中許多復雜的細胞過程［4］。例如，LncRNA人去泛素化酶含有卵巢腫瘤結構域的6B反義RNA1（OTUD6B-AS1）被證實在肝癌中高表達［5］，然而，其在肝癌預后中的作用仍不清楚。微RNA（miRNA）是基因表達過程中重要調節因子，參與調控癌細胞增殖、轉移、侵襲等過程，其在癌癥中功能已得到普遍認可。miR-365a-3p在多種類型癌癥中具有抑癌作用，已有研究表明miR-365a-3p能夠通過靶向抑制E2F2表達，從而抑制肝癌細胞增殖［6］；且另有研究認為，miR-365a-3p可作為肝細胞癌的預后生物標志物［7］。本研究通過Starbase數據庫預測得出miR-365a-3p可能與LncRNA OTUD6B-AS1存在靶向關系。于是，在本研究中首先對肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p的表達進行檢測，進而評估了其表達與預后的相關性，以期為肝癌病人做出最佳的臨床治療決策提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015年3月至2017年3月海南醫學院第一附屬醫院收治的肝癌病人86例（肝癌病人組），和同期體檢的健康志愿者86例（健康對照組）。其中肝癌病人組男性54例，女性32例，年齡（55.32±5.38）歲。健康對照組男性48例，女性38例，年齡（54.25±4.86）歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。另外，收集整理肝癌病人腫瘤長徑、TNM分期等臨床病理特征資料。

納入標準：①符合《原發性肝癌診療規范（2017年版）》［8］中診斷標準；②具備手術指征，行手術切除，術后經病理確診為肝細胞癌；③病人入組前未接受過靶向治療等相關治療項目；④病人或其近親屬在充分了解研究目的和過程后簽署知情同意書；⑤臨床資料均完整，且獲得長期隨訪。排除標準：①合并其他腫瘤；②患有腎臟疾病；③入院前感染；④合并嚴重的心腦功能障礙；⑤不愿配合后續研究；⑥有免疫缺陷。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 血清及組織樣品收集 采集所有研究對象的外周血（5 mL），靜置30 min，然后在3 000 r/min和25 ℃下離心10 min，收集血清用于后續檢測。收集術中切除的肝癌組織及對應的癌旁組織，立即置于液氮中，隨后放置在-80 ℃貯存。

1.3 血清及組織中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達檢測 RNA分離試劑盒（15596018，美國Invitrogen）從血清樣本及組織樣本中提取總RNA。按照TransScript Green兩步qRT-PCR Super-Mix試劑盒（AQ201-01，北京TransGen Biotech）說明書進行逆轉錄，并在StepOne? Real-Time PCR系統（美國Applied Biosystems）上進行LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p表達檢測。以β-actin或U6為內參使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息學分析 使用Starbase數據庫對LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p之間的靶向關系進行分析。

1.5 隨訪 隨訪5年，采用電話、微信隨訪，來院復查形式進行定期隨訪，獲取疾病情況及生存資料，隨訪截止2022年4月30日，記錄術后5年累積生存時間，即術后第1天至死亡時間。

1.6 統計學方法 本研究采用SPSS 22.0進行數據分析。GraphPad prism7用于繪制圖像。計數資料以例（%）表示，組件比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較為獨立樣本t檢驗或配對t檢驗。Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達的相關性。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過log-rank檢驗比較生存率差異。Cox回歸模型分析肝癌病人預后的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清及組織中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平比較 肝癌病人組血清LncRNA OTUD6B-AS1表達水平高于健康對照組，miR-365a-3p表達水平低于健康對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平比較/

表2 兩組血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平比較/

組別健康對照組肝癌病人組t值P值例數86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 1.02±0.32 1.59±0.41 10.16＜0.001 miR-365a-3p 1.05±0.26 0.42±0.15 19.46＜0.001

肝癌組織LncRNA OTUD6B-AS1表達水平高于對應的癌旁組織，miR-365a-3p表達水平低于對應的癌旁組織（P＜0.05），見表3。

表3 肝癌病人肝組織LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平比較/

表3 肝癌病人肝組織LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平比較/

組別癌旁組織肝癌組織t值P值例數86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 0.97±0.16 1.70±0.44 14.46＜0.001 miR-365a-3p 1.01±0.14 0.53±0.17 20.21＜0.001

2.2 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達與臨床病理特征的相關性 以肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平中位數（1.57、0.43）為界限，其中LncRNA OTUD6B-AS1表達水平＞1.57的病人為LncRNA OTUD6B-AS1高表達組（n=43），≤1.57的病人為LncRNA OTUD6B-AS1低表達組（n=43），miR-365a-3p表達水平＞0.43的病人為miR-365a-3p高表達組（n=43），≤0.43的病人為miR-365a-3p低表達組（n=43）。結果顯示，肝癌病人血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度有關（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤長徑、乙肝病毒、血管侵犯無關（P＞0.05）。見表4。

表4 肝癌病人86例血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達與臨床病理特征的相關性/例（%）

2.3 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達的相關性分析 經Starbase數據庫預測發現，LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p之間存在靶向結合位點，經Pearson相關性分析顯示，肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達呈現負相關（r=-0.47，P＜0.05）。見圖1。

圖1 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達的相關性

2.4 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表達與預后的相關性 所有病人隨訪5年，死亡64例，86例肝癌病人的生存率為25.58%（22/86）。LncRNA OTUD6B-AS1低表達組生存率37.21%（16/43）高于LncRNA OTUD6B-AS1高表達組13.95%（6/43）（χ2=6.11，P=0.013）；miR-365a-3p高表達組生存率41.86%（18/43）高于miR-365a-3p低表達組9.30%（4/43）（χ2=8.03，P=0.005）。

以預后（死亡=1，存活=0）為自變量，將單因素分析有差異因素為自變量，多因素Cox回歸分析顯示，LncRNA OTUD6B-AS1高表達以及miR-365a-3p低表達是影響肝癌病人死亡的獨立危險因素（P＜0.05）。見表5。

表5 Cox回歸分析影響肝癌86例預后的影響因素

3 討論

肝癌是全球最常見的胃腸道惡性腫瘤，好發于過度飲酒、感染肝炎病毒、肝硬化等人群，近年來發病率和死亡率呈明顯的上升趨勢，危害大［9］。由于早期肝癌的臨床癥狀比較隱蔽，診斷時病情常較嚴重，即可能已發展至中期，甚至是晚期，臨床治療效果不好。且早發現、早治療的肝癌病人較中晚期病人生存時間長。因此，探討能輔助評估肝癌病人預后的指標至關重要。

LncRNA是長度超過200 nt非編碼RNA，在表觀遺傳變化、轉錄調控和轉錄后修飾中發揮作用［10］，通過對miRNA和靶蛋白的靶向調控，參與各種疾病的發生和發展。已有研究表明LncRNA參與并調控腫瘤細胞增殖、遷移、上皮間質轉化等過程，與肝癌等多種惡性腫瘤有關［11］。LncRNA OTUD6BAS1也是LnRNA中的一員，近期張小博等［5］報道也證明LncRNA OTUD6B-AS1可促進肝癌細胞發展。另有學者發現，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌組織中高表達，通過miR-664b-3p調節GSKIP/Wnt/β-catenin信號傳導增強肝癌細胞增殖和侵襲［12］。本研究結果顯示，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌病人血清及肝癌組織中高表達，與既往報道一致［12］，且與肝癌病人的TNM分期、淋巴結轉移以及分化程度有關，說明LncRNA OTUD6B-AS1表達升高可能參與肝癌發生及病情惡性進展，其機制可能與LncRNA OTUD6B-AS1能靶向調控肝癌病理機制中關鍵基因進而調控信號轉導有關。

miRNA作為一種新型生物標志物，在癌細胞的細胞周期、分化和細胞凋亡中發揮著至關重要的作用［13］。大量研究表明，miR-365a-3p在多種人類癌癥中充當腫瘤抑制因子，如Yang等［14］表明miR-365a-3p過表達可誘導胃癌細胞周期停滯在G1期，顯著抑制細胞增殖；黃君華等［15］研究顯示，miR-365a-3p與三陰性乳腺癌的不良進展相關，可通過調節JAKSTAT通路抑制腫瘤惡性進展。但miR-365a-3p在肝癌中的作用尚不清楚，因此，本研究檢測了血清及肝癌組織中miR-365a-3p表達情況，結果顯示，肝癌病人血清及肝癌組織中miR-365a-3p表達降低，說明miR-365a-3p可能與肝癌的發生有關，且血清與癌組織中miR-365a-3p表達具有一致性。進一步研究發現，miR-365a-3p表達與肝癌病人TNM分期、淋巴結轉移、分化程度有關，提示miR-365a-3p可能參與并影響肝癌發展過程，其可能在肝癌發病過程中發揮抑癌基因作用。本研究還發現，LncRNA OTUD6B-AS1高表達與miR-365a-3p低表達肝癌病人具有更低的5年累積生存率，且LncRNA OTUD6B-AS1高表達及miR-365a-3p低表達均為肝癌病人預后不良獨立危險因素，提示LncRNAOTUD6B-AS1與miR-365a-3p可作為評估肝癌預后的標志物。另外，通過Starbase數據庫分析發現，LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p存在結合位點，相關性分析也證實肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1與miR-365a-3p表達水平呈明顯負相關，說明二者可能共同參與肝癌發生發展。

綜上所述，肝癌病人血清及肝癌組織中LncRNA OTUD6B-AS1表達上調，miR-365a-3p表達下調，與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度有關，二者的異常表達可作為肝癌病人的預后評估標志物。然而，本研究仍存在不足之處，肝癌病人中乙肝病毒感染率較高，可能影響LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p檢測水平的準確性；LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p參與肝癌的具體調控機制還需深入探究。