去整合素-金屬蛋白酶17、Notch1及α-平滑肌動蛋白在子宮內膜異位癥組織中的表達及意義

湯孟冬，張浩然，崔文杰，潘姿璇，張旭艷，2

作者單位：1濰坊醫學院婦產科教研室，山東 濰坊261000；2青島大學附屬青島市海慈醫院（青島市中醫醫院）婦二科，山東 青島266000

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦科一種良性疾病，其最主要的特征是子宮腔外存在子宮內膜的腺體及間質［1-2］。這種疾病嚴重影響病人的生活質量，特別是育齡期女性，也是一個重大的公共衛生問題［3-4］。盡管這種疾病的發病機制尚不完全清楚，但目前研究發現子宮內膜異位癥是一種復雜的慢性炎癥狀態［5］，與前列腺素、金屬蛋白酶、細胞因子和趨化因子的過度產生有關，這些炎性因子產生一個自我支持的循環，維持并增加疾病的發展［6］。研究表明炎性因子的過度激活在不同形式子宮內膜異位癥的發病和進展中起著關鍵作用，如卵巢子宮內膜異位癥和深層浸潤性子宮內膜異位癥［7］。Notch蛋白是一種跨膜受體，調節許多疾病的發生過程。ADAM家族成員對多種具有免疫相關性的靶蛋白（例如Notch1）具有蛋白水解活性［8］。本研究的目的是將ADAM17與Notch介導的纖維化聯系起來，進行EMs的發病機制與臨床病理學的相關性研究。本課題分析ADAM17、Notch1、α-SMA在EMs異位內膜、在位內膜與正常內膜中的表達差異，評估這三種因子在EMs中的作用，并評估不同分期的EMs中ADAM17的表達程度與纖維化嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年10月至2020年10月在濰坊醫學院附屬醫院婦科行腹腔鏡手術治療的卵巢型子宮內膜異位癥病人40例為異位內膜組，手術過程中留取卵巢型子宮內膜異位癥囊腫的囊壁組織；同期選取因子宮切除或行刮宮術獲得子宮內膜的在位內膜組25例；因子宮肌瘤而行全子宮切除術獲得正常子宮內膜的正常內膜組25例。三組年齡范圍為25～50歲，年齡差異無統計學意義（P＞0.05） 。按 1996年美國生殖醫學協會修改的子宮內膜異位癥r-AFS分期，分為Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～ Ⅳ期20例。所有例數在手術治療之前的6個月均未接受激素及其他抗子宮內膜異位癥藥物治療，未手術治療且生化指標及血常規指標均正常。知情同意書均術前簽署。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法 三組組織分別以10%甲醛液固定，石蠟包埋，3 μm連續切片，HE染色后顯微鏡下能觀察到典型子宮內膜組織者為入選標本。免疫組化Envision二步法處理標，將組織切片置0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中高火煮沸，轉至低火煮15 min。除去PBS，將內源性過氧化物酶阻斷加入在切片組織區域，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS，加非特異染色阻斷劑，37 ℃孵育60 min。除去非特異性染色阻斷劑，加一抗，除去PBS，加生物素標記的IgG聚合物，室溫孵育50 min，蒸餾水沖洗，用0.01 mol/L的PBS液洗滌4次，每次均5 min。除去PBS，加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS，加DAB顯色液顯色，室溫孵育，顯微鏡下觀察呈色效果，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，流水沖洗藍，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察。

1.3 結果判斷 ADAM17、Notch1、α-SMA的染色結果根據Watanabe免疫組化半定量評分標準： 高倍鏡（×400）下對每張切片任意選5個視野，計數200個細胞/視野，共計1 000個細胞，觀察陽性細胞的表達強度，視野中無表達為陰性（0分）、細胞呈淺黃色為可疑陽性（1分）、棕黃色為陽性（2分）、棕褐色為強陽性（3分）。計算陽性細胞的表達個數（取5個視野的平均數），無表達為陰性（0分）、1%～15%為可疑（1分）、16%～50%為弱陽性（2分）、51%～75%為陽性（3分）、76%～100%為強陽性（4分）。評分結果：1～2分為陰性（-）；3～4分為弱陽性（+） ； 5～7分為中等陽性（2+）；＞7分為強陽性（3+）。結果判斷均由兩名高年資病理醫生盲法判斷。

1.4 指標觀察 比較三種不同內膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達；分析子宮內膜異位癥中異位內膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達與病理特征的關系；采用Pearson相關分析法分析ADAM17、Notch1、α-SMA在三組中表達的相關性。

1.5 統計學方法 實驗數據通過SPSS 25進行分析，計量資料數據運用表述，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較釆用單因素方差分析（one-way ANOVA），相關性分析用GraphPad PRISM 7進行Pearson分析，并完成制圖，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM17、Notch1、α-SMA在免疫組化中的表達 ADAM17、Notch1、α-SMA主要表達于腺上皮細胞及部分間質胞質中，ADAM17、Notch1主要表達于細胞胞質中，α-SMA主要表達于間質中。可發現三者在正常內膜、EMs在位內膜及異位內膜組織中的染色強度為淺黃色至棕褐色，與切片的背景對比發現，EMs異位內膜及在位內膜中的細胞表達數量及染色深度明顯高于正常內膜，表達強度比較為EMs異位內膜＞EMs在位內膜＞正常內膜。見圖1。

圖1 ADAM17、Notch1及α-SMA在三種子宮內膜組織中的表達（免疫組化染色×200）

2.2 ADAM17、Notch1、α-SMA表達的相關性 異位內膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達均呈高水平，高于在位內膜組及正常內膜組，在位內膜組中表達均高于正常內膜組，均差異有統計學意義。見表1。

表1 三組子宮內膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達/

表1 三組子宮內膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達/

組別異位內膜組在位內膜組正常內膜組F值P值例數40 25 25 Watanabe 免疫組化半定量評分值ADAM17 4.77±1.35 3.24±1.09 2.36±1.22 30.98＜0.001 Notch1 4.40±1.24 3.44±0.96 2.24±1.01 29.49＜0.001 α-SMA 4.42±1.30 3.36±0.95 2.16±1.03 30.67＜0.001

異位內膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關（P＜0.001）。在位內膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關（P＜0.001）。正常內膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均無明顯相關性（P＞0.05）。見表2。

表2 ADAM17、Notch1、α-SMA在三組子宮內膜組織中表達的相關性

2.3 ADAM17、Notch1、α-SMA與臨床病理特征的相關性表達 異位內膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA在Ⅲ～Ⅳ期中的表達高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義（P＜0.001）。在EMs病人中異位內膜組中ADAM17、NOTCH1、α-SMA的表達與年齡和囊腫長徑差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內膜組織中的表達與病理特征的關系/

表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內膜組織中的表達與病理特征的關系/

組別EMs分期例數ADAM17NOTCH1α-SMAⅠ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期t值P值囊腫長徑≤5 cm＞5 cm t值P值年齡≤35歲＞35歲t值P值-5.37＜0.001-5.98＜0.001-5.75＜0.001 24 16 4.74±1.33 4.88±1.41-0.38 0.707 4.38±1.25 4.44±1.26-0.16 0.878 4.39±1.37 4.63±1.20-0.79 0.434 22 18 4.68±1.56 4.89±1.08-0.48 0.635 4.45±1.34 4.33±1.14 0.30 0.762 4.27±1.42 4.61±1.43-0.82 0.419 20 20 3.90±1.07 5.65±0.99 3.55±0.10 5.25±0.79 3.55±0.19 5.30±1.08

3 討論

EMs是子宮內膜的腺體和間質出現在子宮體以外的部位，可根據病理類型分為卵巢型、腹膜型和深部浸潤型等，繼發性痛經進行性加重是其最主要的臨床表現［9-10］。1921年Sampson提出經血逆流與種植理論，即經血逆流后，具有活性的子宮內膜細胞黏附在腹膜表面逐漸形成子宮內膜異位組織。該學說不能解釋大多數女性都會出現經血逆流，但只有一部分女性出現EMs這一現象［11］。2005年郎景和院士提出子宮內膜異位癥發病的“在位內膜決定論”，研究證明了EMs病人和非EMs病人的在位內膜在血管形成、黏附肌侵襲性等能力均有差異，通過獼猴動物的模型構建，更說明了EMs的“在位內膜決定論”［12］。目前研究發現，子宮內膜在盆腔內的擴散、附著、植入和纖維化，以及異位病變的形成和發展，受到多個因子的綜合影響［13-14］。

ADAM17作為一種具有膜黏附的金屬蛋白酶，在細胞分化和細胞增殖中起到一定的作用，通過脫落生長因子和激活表皮生長因子受體信號，對多種具有免疫相關性的靶蛋白（例如Notch1）具有蛋白水解功能［6］。子宮內膜異位癥的遷移、黏附、血管生成、等類腫瘤行為，ADAM17作為一種膜黏附的蛋白酶，亦在子宮內膜異位的發生和發展中起著重要作用［7］。氧化應激能夠誘導去整合素、金屬蛋白酶家族的一些成員的合成，并在不同形式的EMs如卵巢EMs和深部浸潤性EMs的發病和進展中起著關鍵作用。Foruria等［16］發現ADAM17/Notch信號通路在EMs中的作用。ADAM17、Notch1、Jagged1和Hes1在小鼠的子宮異位癥中過度表達，會導致輔助T細胞（TH）17的增加和調節性T細胞（Tregs）的減少，會導致小鼠EMs的增加。阻斷Notch信號可以減少骨髓源性抑制細胞（MDSCs）（未成熟髓系細胞的異質性亞群），從而減少EMs的發生［16］。與沒有EMs的正常女性相比，由于ADAM17基因轉錄的激活，導致ADAM17蛋白在EMs異位組織中的過度表達。盡管以前曾報道過EMs病人異位部位腺上皮和腔上皮中ADAM17蛋白水平升高，但這種蛋白表達增強與ADAM17轉錄物水平的變化無關［17-18］。ADAM17表達水平的這些細胞變化與病變實體、月經周期無關［19］。因此，細胞內ADAM17調節過程的更強激活可能存在生物學選擇，支持異位病變的形成并促進其存活，例如增強子宮內膜細胞遷移、黏附和侵襲，炎癥反應增加和免疫反應受損，這些還需進一步研究。本課題研究發現，ADAM17在EMs病變中的表達高于在位子宮內膜，并且與對照組相比，患有EMs的女性在位子宮內膜中的ADAM17表達也更高，再次證實了EMs的“在位內膜決定論”，這與國內外研究一致，ADAM17在EMs的發生及發展中起到促進作用。EMs異位組織對照術中按r-AFS進行分期，發現ADAM17在Ⅲ～Ⅳ期的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，表明該因子與內異癥的嚴重程度及進展有關。本課題也發現，ADAM17、Notch1及α-SMA在內異癥的異位內膜組織中呈正相關表達，表明ADAM17協同Notch1促進EMs的纖維化。

Notch信號是一種高度保守的跨越種系的通路，廣泛見于多細胞生物的機體。它在細胞間通信中發揮作用，調節各種細胞在胚胎和人類中的發育進程［20］。Notch信號是通過4個跨膜的受體（Notch 1-4）及5個跨膜的配基來表達的。Notch的活化主要依靠功能重組信號序列結合蛋白的啟動，誘導鄰近的細胞產生與其受體及配基之間的交互反應，從而引發一系列的受體破壞，從而使Notch胞內區的形成得以實現。然后，將缺口胞內域（notch intracellular domain ，NICD）切入細胞核，與Notch家族的轉錄因子重組信號鍵結合，進而啟動 Notch靶標基因的表達［21-22］。目前發現皮膚、肺、腎和心臟纖維化與Notch激活有關，細胞內NICD異位到細胞核內，可直接啟動細胞核內合成α-SMA和膠原纖維Ⅱ基因的轉錄和翻譯，誘導纖維組織增生引起的纖維變性［23］。本課題組研究發現，Notch1在EMs異位病變中的表達高于在位子宮內膜，并且與對照組相比，患有EMs在位子宮內膜中的Notch1也表達，均差異有統計學意義。這說明Notch在EMs的發生及發展中起到促進作用。在于ADAM17的相關性分析中發現，ADAM17、Notch1在子宮內膜的異位內膜組織中呈正相關，由此可見，Notch通路在EMs中起到促進作用，這一通路的研究發現為內異病的診治提供了新途徑。

α-SMA是平滑肌細胞的標志，是檢測細胞上皮向間質轉化的指標，這一蛋白質活化在纖維的生成過程中起關鍵作用，可作為檢測組織纖維化的指標。EMs過度纖維化可通過臨床表現有所體現，卵巢型EMs主要因粘連和疤痕形成導致病人疼痛和不孕等臨床表現。在患有EMs病人的卵巢中可觀察到伴隨卵泡丟失的纖維化現象，表明該疾病導致卵巢功能改變［24-25］。纖維化是EMs病理生理學機制發展的重要過程［26］。抑制纖維組織的形成可能是治療EMs的一個方向。本課題研究發現，EMs病人的異位內膜組與ADAM17、Notch1及α-SMA的表達水平之間存在顯著正相關，與對照組相比，EMs在位內膜組織表達水平也顯著升高，差異具有統計學意義，提示ADAM17與Notch1促進EMs的纖維化，參與EMs的發病機制。ADAM17可能通過Notch通路引起EMs纖維化。更重要的是，我們的研究發現EMs中Ⅲ～Ⅳ期病人的異位組織中，三者的表達均高于Ⅰ～Ⅱ期，這就表明ADAM17可能通過Notch通路調控內異癥的纖維化嚴重程度，可以為治療內異病的臨床研究開辟新途徑。從而為臨床上對內異癥的治療提供了新的思路。

本課題的研究生發現ADAM17、Notch1及α-SMA在EMs異位內膜的中的表達與病人的年齡及囊腫大小無關，但與分期呈正相關，即卵巢型子宮異位癥的纖維化程度與ADAM17及Notch1的表達呈正相關，說明干擾這兩者的表達，可能會減輕EMs的纖維化，但仍需進行相關抑制劑研究來證實。

4 結論

ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內膜中較在位內膜及正常內膜中表達均偏高，在位內膜中ADAM17、Notch1和α- SMA的表達比正常的內膜高，符合“在位內膜決定論”，提示這三種蛋白在EMs的發生、發展中起到重要的作用。三者在異位內膜及在位內膜中均兩兩呈正相關，提示ADAM17可能通過Notch通路參與EMs的纖維化發生。三者在內異癥Ⅲ～Ⅳ期病人的異位內膜的表達均高于Ⅰ～Ⅱ期，提示ADAM17可能通過Notch通路調控EMs的纖維化嚴重程度。

關于ADAM17在健康和疾病中的結構和功能已經有大量研究，ADAM17參與免疫系統、纖維化和癌癥進展的關鍵途徑，抑制ADAM17已被證明是一種有前途的治療策略［26-28］。盡管如此，仍需進行進一步研究，以開發新的特異性ADAM17抑制劑，并測試其EMs進展中的益處。盡管本課題為EMs的病因和尋找有效的治療目標，仍有待深入地研究。

我們通過免疫組化實驗發現ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內膜、在位內膜及正常內膜中有不同程度的表達，定位表達亦能明顯觀察到，但定量不明確，內容較簡單，樣本數較局限，可考慮聯合其他醫院樣本進行研究。希望之后的實驗可結合動物實驗及細胞擴增實驗進行更系統的研究，并結合相關抑制劑進行研究。