重癥急性胰腺炎病人外周血微RNA-143-3p、環氧合酶-2表達水平與輔助性T細胞17/調節性T細胞平衡的關系

鄧雍，馬濤，張寧

作者單位：1榆林市第一醫院重癥醫學科，陜西 榆林719000；2榆林市第二醫院消化內科，陜西 榆林719000

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）是一種急腹癥，其有輕癥AP（mild acute pancreatitis， MAP）與重癥AP（severe acute pancreatitis，SAP）兩種類型，其中SAP病情進展迅速、病死率高［1-2］。因此，尋找與SAP病理發展的相關因素，對及時制定干預措施，改善SAP病人生存狀況有積極意義。研究認為，SAP與微RNA（microRNA，miRNA）表達失調、膽道感染、免疫紊亂、飲酒過量、炎癥反應等有關［3-4］。研究發現，微RNA-143-3p（microRNA-143-3p，miR-143-3p）在支原體肺炎中呈低表達，其可能通過調節肺部炎癥反應進而影響肺炎病理進展［5］；環氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）在AP中表達水平升高，COX-2抑制劑可通過降低炎癥反應進而抑制SAP發展［6］；且Li等［7］研究發現，miR-143-3p可靶向調節COX-2表達水平；此外，輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）/調節性T細胞（regulatory T cells， Treg）在SAP中水平較高，Th17/Treg可能參與SAP病變過程［8］。基于上述研究，本研究通過測定SAP病人外周血中miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平，旨在分析其與Th17/Treg平衡的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2020年9月榆林市第一醫院收治的AP病人103例為研究對象，男68例，女35例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.52±15.17）歲。納入標準：（1）病人符合《中國急性胰腺炎診治指南（2013年，上海）》［9］中AP診斷標準；（2）病人發病6 h內入院；（3）病人首次發生AP。排除標準：（1）合并HIV感染、惡性腫瘤者；（2）合并妊娠、乙肝、糖尿病者；（3）有慢性胰腺炎病史者；（4）合并自身免疫性疾病者。對所有AP病人進行急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ， APACHE Ⅱ）評估，按APACHEⅡ評分將其分為SAP組（APACHEⅡ評分≥8分，45例）和MAP組（APACHEⅡ評分＜8分，58例）。SAP組：男29例，女16例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.94±15.53）歲。MAP組：男39例，女19例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.19±15.10）歲。并納入同期體檢健康者55例為健康組，男36例，女19例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.13±15.05）歲。三組性別比例、年齡比較，差異無統計學意義（χ2=0.09，P=0.930；F=0.04；P=0.958）。受試者對本研究知情同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 研究方法 收集AP病人入院時和體檢健康者體檢當日5～6 mL空腹外周血，分成兩份，1份靜置30 min后以4 200 r/min離心7 min，留取上清液（血清），置于-70 ℃環境中保存；另1份置于含肝素的抗凝管中，待檢。

利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測血清miR-143-3p、維甲酸相關孤核受體（retinoic acid-related orphan receptorγt，RORγt） mRNA、COX-2 mRNA、叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3（forkhead or winged helix transcription，Foxp3） mRNA表達水平，具體操作如下：解凍血清，以TRIzol LS Reagent（上海信裕生物科技有限公司，XY1901B）提取總RNA；采用HiScript 1st Strand cD-NA Synthesis Ki（t南京諾唯贊生物科技股份有限公司，R111-01/02）制備cDNA；最后，以SYBR Green Realtime PCR Master Mix（美國ToYoBo公司，QPK-212）、qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96）獲取各指標循環閾值（CT值）。qRT-PCR儀參數：96.4 ℃5 min；94.5 ℃ 15 s，59.5 ℃ 40 s，62.5 ℃ 20 s，40個循環。RORγt、COX-2、Foxp3以GAPDH為內參，miR-142-5p以U6為內參，引物序列見表1。

表1 miR-143-3p、U6、RORγt、COX-2、Foxp3、GAPDH的引物序列

miR-143-3p、RORγt、COX-2、Foxp3 mRNA相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

Th17、Treg細胞水平檢測：取抗凝管內的外周血，利用人Ficoll淋巴細胞分離液（上海瓦蘭生物科技有限公司，wlb1083）按密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞（PBMCs），以RPMI 1640培養液（廈門慧嘉生物科技有限公司，GMS12052.4.1）稀釋PBMCs，其密度為1.5×109個/升，使用流式細胞儀（美國BD公司，FACSCanto Ⅱ）測定Th17、Treg細胞百分比，計算Th17/Treg。

1.3 統計學方法 SPSS 22.0軟件處理數據。計量資料均符合正態分布，以表示，行單因素方差分析。采用SNK-q檢驗；Pearson相關法分析SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關性； SAP發生的影響因素采用logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較 與健康組相比，MAP組、SAP組病人血清miR-143-3p表達水平及Treg細胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表達水平及Th17細胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）；與MAP組相比，SAP組病人血清miR-143-3p表達水平及Treg細胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表達水平及Th17細胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較/

表2 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較/

注：miR-143-3p為微RNA-143-3p，COX-2為環氧合酶-2，Th17為輔助性T細胞17，Treg為調節性T細胞。SAP為重癥急性胰腺炎，MAP為輕癥急性胰腺炎。①與健康組相比，P＜0.05。②與MAP組相比，P＜0.05。

Th17/Treg 0.23±0.08 0.63±0.21①2.46±0.82①②325.93＜0.001組別健康組MAP組SAP組F值P值例數55 58 45 miR-143-3p 1.04±0.35 0.70±0.23①0.42±0.14①②71.25＜0.001 COX-2 mRNA 1.01±0.34 1.68±0.48①2.37±0.54①②110.46＜0.001 Th17/%1.99±0.66 3.87±1.29①6.71±2.34①②119.40＜0.001 Treg/%8.74±2.91 6.13±2.04①2.73±0.90①②94.93＜0.001

2.2 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較 與健康組、MAP組相比，SAP組病人血清RORγt mRNA表達水平升高（P＜0.05），Foxp3 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與健康組相比，MAP組病人血清RORγt mRNA表達水平升高（P＜0.05），Foxp3 mRNA表達水平降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較/

表3 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較/

注：RORγt為維甲酸相關孤核受體，Foxp3為叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3，SAP為重癥急性胰腺炎，MAP為輕癥急性胰腺炎。①與健康組相比，P＜0.05。②與MAP組相比，P＜0.05。

例數55 58 45 RORγt mRNA 1.05±0.35 1.72±0.57①2.44±0.81①②68.73＜0.001組別健康組MAP組SAP組F值P值Foxp3 mRNA 1.03±0.34 0.56±0.19①0.31±0.11①②119.44＜0.001

2.3 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg相關性Pearson相關法分析顯示，SAP病人血清miR-143-3p表達水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清COX-2 mRNA表達水平與Treg、Foxp3 mRNA呈負相關（P＜0.05）；血清miR-143-3p表達水平與Treg、Foxp3 mRNA及血清COX-2 mRNA表達水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相關（P＜0.05）。SAP病人血清miR-143-3p表達水平與COX-2 mRNA呈負相關（r=-0.40，P=0.070）。見表4。

表4 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關性

2.4 影響SAP發生的logistic回歸分析 以SAP是否發生為因變量（未發生=0，發生=1），以Th17、RORγt mRNA、Treg、Foxp3 mRNA、Th17/Treg、miR-143-3p、COX-2 mRNA為自變量，納入logistic回歸分析，結果顯示，miR-143-3p是影響SAP發生的保護因素（P＜0.05），COX-2 mRNA、Th17/Treg是影響SAP發生的危險因素（P＜0.05）。見表5。

表5 logistic回歸分析SAP發生的影響因素

3 討論

SAP是一種全身炎癥反應綜合征，其可引發胰腺組織出血、水腫、壞死，引起多器官功能障礙，甚至導致死亡［10-11］。因此，尋找與SAP病理變化有關的標志物，對診治SAP、改善SAP病人生存質量甚是重要。

miRNA是一類非編碼RNA，其可調節炎癥反應，參與免疫調節，影響信號轉導，與胰腺癌、膽囊炎、AP等密切相關［12-14］。研究［15］發現，miR-143-3p在支氣管哮喘中表達水平降低，其可能通過影響炎癥反應及支氣管細胞凋亡，從而在支氣管哮喘中發揮作用；另外，miR-143-3p在胰腺導管腺癌中表達下調，其可能靶向結合有關基因進而抑制胰腺導管腺癌病理發展，miR-143-3p可能是治療胰腺導管腺癌的潛在靶標［16］。本研究中SAP組病人血清miR-143-3p表達水平低于MAP組、健康組，提示miR-143-3p表達失調可能與SAP病理過程相關，且測定血清miR-143-3p水平，有助于臨床評估AP病人病情，推測miR-143-3p作為miRNA的一員，其可能通過影響炎癥反應，進而影響SAP發病過程。COX-2是一種誘導酶，定位于內質網、核膜，其可被炎性介質等多種因子誘導，促進炎癥反應，加劇組織損傷，與胰腺癌、胰腺炎等關系密切［17-18］。研究［19］發現，COX-2在黏液性胰腺囊腫中過表達，其可能促進黏液性胰腺囊腫病理發展；另外，COX-2在SAP中呈高表達，COX-2可能參與SAP發生發展［20］。本文中SAP組病人血清COX-2 mRNA表達水平高于MAP組、健康組，與文玲等［20］研究趨勢相符，提示COX-2 mRNA可能與SAP發展進程有關，其具有評估AP疾病嚴重程度的價值，推測COX-2可能促進炎癥反應進而加速SAP發生發展。

Th17/Treg平衡是維持機體免疫平衡的重要環節，其在SAP中水平較高，Th17/Treg可能影響SAP發病進程［21］。本文中SAP、MAP組病人Th17細胞百分比、Th17/Treg高于健康組，Treg細胞百分比低于健康組，且AP病人病情越嚴重，Th17細胞百分比、Th17/Treg越高，Treg細胞百分比越低，與趙瑞臣等［8］研究結果相符，提示Th17/Treg失衡可能影響SAP病理進展。且RORγt是Th17細胞的關鍵轉錄因子，其可調節IL-17分泌，參與Th17細胞分化，調節炎癥反應；另外，Foxp3作為Treg的重要轉錄因子，可與染色體結合，影響Treg細胞發育，調節有關基因表達［22-23］。近期研究發現，SAP病人RORγt mRNA表達水平較高，Foxp3 mRNA表達水平較低，40例SAP病人入院后給予清胰利膽顆粒與床旁CRRT療法聯合治療后，RORγt mRNA表達水平降低（t=24.59，P＜0.001），Foxp3 mRNA表達水平水平升高（t=44.17，P＜0.001），RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能參與SAP疾病進展［24］。本研究顯示，SAP、MAP病人血清RORγt mRNA表達水平高于健康者，血清Foxp3 mRNA表達水平低于健康者，且SAP病人血清RORγt mRNA表達水平高于MAP病人，血清Foxp3 mRNA表達水平低于MAP病人，與李芳等［24］研究相似，提示RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 可能與SAP病理發展有關，推測RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能通過影響機體免疫功能，進而影響SAP病理過程。

本研究分析了SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平與Th17/Treg平衡的關系，結果顯示，血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達水平與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg均顯著相關，提示miR-143-3p、COX-2 mRNA可能與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg共同影響SAP病理變化。此外，SAP病人血清miR-143-3p表達水平與COX-2 mRNA呈負相關，提示miR-143-3p可能與COX-2 mRNA協同影響SAP發生發展，但其具體機制有待深入研究。進一步研究發現，血清miR-143-3p水平降低，COX-2 mRNA水平、Th17/Treg升高均可能會升高SAP發生風險，及時確定miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17/Treg水平有助于臨床診治SAP。

綜上，SAP病人血清miR-143-3p表達水平較低，COX-2 mRNA表達水平較高，miR-143-3p、COX-2 mRNA均與Th17/Treg平衡有關，miR-143-3p可能是治療SAP的潛在靶標。但本研究對miR-143-3p在SAP中的作用機制研究仍不夠深入，后續將擴大樣本從多角度進行研究。