微RNA-223在慢性阻塞性肺疾病血清外泌體中的表達

任明慧

作者單位：濟寧市第一人民醫院老年醫學科，山東 濟寧272000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的呼吸系統疾病，主要表現為咳嗽、咳痰、氣促、喘息、胸悶、疲乏等癥狀，有慢性致殘、反復發作的特點，且肺功能不可逆轉，嚴重時可發展為肺心病與呼吸衰竭，給病人身心健康帶來很大影響［1-2］。因此，對COPD病人早期診斷、判斷病情具有重要意義。外泌體（exosomes）是細胞外囊泡，可攜帶多種蛋白質、脂類和核酸，可在細胞間進行信息傳遞，在免疫反應、炎癥反應等過程中發揮重要作用［3］。微RNA（microRNA，miRNA）有多種生理學功能，可參與COPD、肺結核、哮喘、肺癌等肺部疾病的發病過程［4］。miRNA-223在先天免疫、炎癥反應等多種生理病理過程中具有關鍵作用，與多種炎癥性疾病有關［5］。在肺結核大鼠中，過表達miR-223可抑制STAT3信號通路增強肺泡巨噬細胞的吞噬能力［6］。miRNA-223在COPD病人肺組織、COPD小鼠模型中miR-223的表達水平升高，體外實驗顯示，在肺動脈內皮細胞中miR-223靶向組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）調控趨化因子水平，參與COPD的炎癥反應［7］。以上表明，miRNA-223在肺部疾病中發揮重要作用，miRNA-223在COPD病人血清外泌體中的研究尚未見報道，本研究檢測COPD病人血清外泌體中miRNA-223表達情況，探討miRNA-223表達與COPD疾病嚴重程度相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年3月至2021年6月在濟寧市第一人民醫院呼吸科治療的穩定期COPD病人113例作為觀察對象（COPD組），其中男67例，女46例，年齡范圍為38～74歲，年齡（57.20±11.50）歲。根據肺功能將COPD病人分為輕度組40例、中度組31例、重度組25例和極重度組17例。納入標準：（1）符合2013年中華醫學會呼吸病學分會COPD診斷標準［8］；（2）病人臨床資料完整；（3）病人近期未使用相關藥物進行治療。排除標準：（1）急性肺栓塞、肺結核、哮喘、肺癌等其他呼吸系統疾病的病人；（2）合并肝腎功能不全、類風濕關節炎等自身免疫系統疾病及其他系統炎癥性疾病病人；（3）合并高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病病人；（4）合并其他腫瘤病人；（5）孕婦或產婦；（6）癡呆、認知功能障礙的病人。

另選取同期在濟寧市第一人民醫院體檢的100例健康體檢人員作為對照組，其中男59例，女41例，年齡范圍為40～76歲，年齡（56.80±11.30）歲。兩組男女比例（P=0.965）、年齡（t=0.26，P=0.799）比較，差異無統計學意義，具可比性。

本研究中病人或其近親屬知情同意，并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要試劑與儀器 人C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）（EK194）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）（EK182）、白細胞介素-6（IL-6）（EK106）檢測試劑盒購自聯科生物科技有限公司，兔抗人CD63、CD9、TSG101多克隆抗體購自Elabsceience公司，Trizol試劑、外泌體提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit）、miScript SYBR Green PCR Kit購自Takara公司。PowerCyclerPCR儀購自德國Analytikjena公司，JEM-2100透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司，P800型全自動生化分析儀購自羅氏公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血清外泌體的提取與鑒定 分別采集COPD病人和健康體檢人員空腹內靜脈血5 mL，室溫下以3 000g離心30 min，然后再以16 000g離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。采用外泌體提取試劑盒提取血清中外泌體，按照試劑盒操作說明書進行操作，電鏡觀察外泌體形態，采用蛋白質印跡法鑒定外泌體表面蛋白CD63及CD9。

1.3.2 血清外泌體miRNA-223水平檢測 采用RT-qPCR檢測血清外泌體miRNA-223相對表達量。Trizol試劑提取血清外泌體總RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA后，進行RT-qPCR擴增。反應條件：95 ℃預變性600 s；95 ℃變性75 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，40個循環。miRNA-223正向引物序列（5′-3′）：CGTGTATTTGACAAGCTG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6正向引物序列（5′-3′）：CTCGCTTCGGCAGCACAT，反向引物序列（5′-3′）：TTTGCGTGTCATCCTTGCG。以對照組人員血清為對照，校正每個樣本外泌體數量，以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算外泌體miRNA-223相對表達量。

1.3.3 肺功能指標及炎性因子水平檢測 肺功能指標：對所有觀察者進行肺功能檢測，采用肺功能檢測儀檢測靜息狀態下第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）、FEV1占預計值百分比（FEV1%pred）、FEV1占用力肺活量（forced vital capacity，FVC）百分比（FEV1/FVC）。

采用酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清炎性因子CRP、TNF-α、IL-6水平，檢測下限分別為0.44 ng/L、0.42 ng/L、0.37 ng/L，具體操作參照其試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 利用SPSS 17.0進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；采用Pearson分析COPD病人血清外泌體miRNA-223與TNF-α、IL-6、CRP、FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC相關性。若P＜0.05，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COPD組與對照組肺功能指標比較 COPD組病人肺功能指標FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC顯著低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 COPD組與對照組肺功能指標比較/

表1 COPD組與對照組肺功能指標比較/

注：FEV1為第1秒用力呼氣容積，FEV1%pred為FEV1占預計值百分比，FEV1/FVC為FEV1占用力肺活量百分比。

FEV1/L 2.83±0.44 1.77±0.62 14.22＜0.001組別對照組COPD組t值P值例數100 113 FEV1%pred 101.87±12.45 62.05±11.38 24.38＜0.001 FEV1/FVC/%86.47±8.08 64.01±11.52 16.27＜0.001

2.2 血清外泌體提取與鑒定 電鏡下結果顯示，血清外泌體為圓形或橢圓形囊泡狀結構，直徑約100 nm；蛋白質印跡法結果顯示，對照組與COPD組外泌體均表達特異性蛋白CD63、CD9、TSG101，見圖1。說明成功提取血清外泌體，可用于后續實驗。

圖1 血清外泌體的鑒定：A為電鏡下顯示外泌體為圓形或橢圓形囊泡狀結構，直徑約100 nm；B為對照組與COPD組外泌體CD63、CD9、TSG101蛋白表達

2.3 COPD組與對照組血清外泌體miRNA-223表達及炎性因子水平比較 與對照組比較，COPD組病人血清外泌體miRNA-223、TNF-α、IL-6、CRP水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 COPD組與對照組血清外泌體miRNA-223表達及炎性因子水平比較/

表2 COPD組與對照組血清外泌體miRNA-223表達及炎性因子水平比較/

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病，miRNA-223為微RNA-223，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素6，CRP為C-反應蛋白。

CRP/（mg/L）1.35±0.47 6.72±1.21 41.68＜0.001組別對照組COPD組t值P值例數100 113 miRNA-223 1.01±0.12 3.05±0.47 42.19＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.83±0.81 5.23±1.14 17.50＜0.001 IL-6/（ng/L）2.47±0.58 5.43±1.05 25.01＜0.001

2.4 不同嚴重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平及炎性因子比較 結果顯示，輕度、中度、重度、極重度COPD病人血清外泌體miRNA-223表達水平依次升高，組內兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）；重度、極重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于輕、中度病人（P＜0.05），輕度與中度、重度與極重度COPD病人之間血清TNF-α、IL-6、CRP水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同嚴重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平比較/

表3 不同嚴重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平比較/

注：miRNA-223為微RNA-223，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細胞介素-6，CRP為C反應蛋白。①與輕度組比較，P＜0.05。②與中度組比較，P＜0.05。③與重度組比較，P＜0.05。

組別輕度組中度組重度組極重度組F值P值CRP/（mg/L）6.20±1.05 6.45±1.21 7.16±0.95①②7.78±1.13①②10.42＜0.001例數40 31 25 17 miRNA-223 2.62±0.25 2.89±0.32①3.21±0.39①②3.52±0.40①②③36.18＜0.001 TNF-α/（ng/L）4.83±0.81 5.12±0.92 5.62±0.85①②5.75±0.91①②6.76＜0.001 IL-6/（ng/L）4.89±0.88 5.25±0.82 5.87±0.91①②6.44±0.93①②15.16＜0.001

2.5 COPD病人血清外泌體miRNA-223與炎性因子及肺功能指標相關性 相關性分析顯示，COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相關，與FEV1%pred 、FEV1、FEV1/FVC呈負相關（均P＜0.05），見表4。

表4 COPD病人血清外泌體miRNA-223與炎性因子及肺功能指標相關性分析結果

3 討論

COPD主要為各種因素引起的肺部持續性的異常慢性炎癥反應，其中TNF-α、IL-6、CRP為炎性因子，是評價COPD病人病情及炎癥程度的標志物［9］；FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC是判斷肺功能的重要指標，可用于評價COPD病人病情嚴重程度［10］。本研究結果顯示，COPD組病人TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于對照組，肺功能指標FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC顯著低于對照組，提示COPD病人體內存在炎癥反應和肺功能損傷。

外泌體是一種直徑40～100 nm的囊泡，內含包括蛋白質、脂質、miRNA等分子結構，外泌體及其miRNA在肺癌、肺纖維化、哮喘、肺損傷等肺部疾病的發生發展中發揮重要作用，成為疾病診斷與治療的標志物［11-12］。研究顯示，多種外泌體miRNA與COPD疾病相關，如謝羽飛等［13］研究表明，COPD病人血清外泌體中miRNA-186相對表達量明顯高于正常對照組，且其與COPD病人的FEV1%預計值呈負相關。miRNA-223為miRNA的一種，與多種炎癥性疾病有關，Neudecker等［14］研究顯示，在急性肺損傷小鼠模型中，miR-223從中性粒細胞到肺上皮細胞的細胞間轉移可能通過抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1）來抑制急性肺損傷。另有研究顯示［15］，哮喘病人中miRNA-223水平升高，且與FEV1、FEV1/FVC比值呈負相關。本研究結果表明，COPD組病人血清外泌體miRNA-223水平顯著高于對照組，提示miRNA-223與COPD病人發病有關；且在輕度、中度、重度、極重度COPD病人中血清外泌體miRNA-223表達水平依次升高，提示miRNA-223與COPD病人病情的嚴重程度有關。研究顯示［16］，miRNA-223可通過抑制TLR4/NF-KB信號通路并抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕甲型流感病毒誘導的肺上皮細胞的炎癥反應。推測miRNA-223可能通過參與調控炎癥反應參與COPD的發生發展。

COPD的具體發病機制復雜，其主要特征為炎性反應、氣道重塑、氣流受限和肺功能下降。研究顯示［17］，COPD病人急性期IL-6、CRP水平高于穩定期，且COPD急性加重期IL-6、CRP水平更高，表明炎性因子與COPD病人病情有關。本研究結果顯示，重度、極重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于輕、中度病人，輕度與中度、重度與極重度COPD病人之間血清TNF-α、IL-6、CRP水平差異不顯著，在多數炎癥性疾病中，炎性因子均有升高，提示TNF-α、IL-6、CRP水平可反映COPD的炎癥狀態，不能反映COPD疾病嚴重程度。相關性分析顯示，COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相關，表明miRNA-223可能通過炎癥反應參與COPD的發病過程，COPD病人TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平增加，可能與NF-κB等炎癥相關信號通路有關。NF-κB的激活可誘導多種促炎基因的表達和炎癥小體的激活，研究顯示，miR-223在培養的人支氣管上皮細胞（HBECs）中表達，下調miR-223可導致NF-κB信號激活［17］。且多數報道顯示，miR-223主要發揮抗炎的作用，下調miR-223的表達可增加炎癥反應，過表達miR-223可抑制促炎因子的釋放［18］。而本文中COPD病人血清外泌體中miRNA-223水平雖升高，但不足以降低TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，此外，miR-223的大多數靶基因在COPD中升高，可能是由于肺局部組織腔室的改變，miR-223的保護作用受損或不足以降低哮喘和COPD中的高炎癥反應。本研究還發現COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC呈負相關，進一步證實miRNA-223與COPD病人病情的嚴重程度有關，血清外泌體miRNA-223水平可反映COPD病人肺功能情況，其可能作為預測COPD發生及其病情嚴重程度的標志物之一。本研究僅分析COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與炎性因子及肺功能的相關性，miRNA-223在COPD中的具體作用機制仍需結合動物模型做更深入的研究。

綜上所述，miRNA-223在COPD病人血清外泌體中表達水平升高，與病人疾病嚴重程度有關，可能作為判斷COPD病情嚴重程度的潛在標志物，為臨床COPD診治提供一定參考，但其具體作用機制仍需做進一步研究。