老鼠艻內生曲霉HU0206的抗細菌活性代謝成分

王瑞, 陳少微, 于燕燕, 李春霞, 姚松錦, 徐良雄*, 陶均*

老鼠艻內生曲霉HU0206的抗細菌活性代謝成分

王瑞1, 陳少微2, 于燕燕1, 李春霞1, 姚松錦2, 徐良雄2*, 陶均1*

(1. 海南大學熱帶作物學院，海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228；2. 惠州學院生命科學學院，廣東 惠州 516007)

為闡明老鼠艻內生曲霉sp. HU0206發酵物的抗細菌物質基礎，采用色譜分離法從其玉米發酵物中分離得到7個化合物，分別鑒定為6個甲基苯酚類化合物：sydowiol F (1)、5-methoxy-3,5′-dimethyl-2,3′-oxybiphenyl-1,1′,2′-triol (2)、corynesidone A (3)、鹿蹄草素(4)、3-羥基鹿蹄草素(5)、4-乙氧基-3-羥甲基苯酚(6)和1個甲基環己酮二聚體epoxydine A (7)，其中化合物1為新化合物。載樣量為40g時，化合物1、2和4對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、黑脛病菌和青枯病菌抑菌效果較好，抑菌圈半徑≥2 mm，最小抑菌濃度(MIC)為50或100g/mL；化合物3對這4種菌雖有1～2 mm的抑菌圈，但MIC大于400g/mL。所有化合物對大腸桿菌均無抑制活性。

內生曲霉；代謝產物；甲基苯酚；甲基環己酮；抗細菌活性

真菌代謝產物是發掘新抗生素的重要來源。甲基苯酚類化合物是由真菌或植物通過聚酮合成途徑形成的一類重要天然產物類型，結構相對簡單、分布廣泛，常以單體、二聚體或三聚體形式存在, 其中不乏具有良好的生物活性。二聚體Violaceol I可抑制枯草芽孢桿菌()、大腸桿菌()、金黃色葡萄球菌()等的生長[1]；二聚體diorcinol不僅具有抗細菌活性，且可抑制黑色素瘤和人結腸直腸癌細胞增殖[2–3]。三聚體sydowiol C不僅可拮抗金黃色葡萄球菌，對結核分枝桿菌()也有良好的抑制活性[4]。

在前期活性篩選中，我們發現一株老鼠艻內生曲霉sp. HU0206的玉米發酵物在載樣量為500g時對金黃色葡萄球菌及馬鈴薯黑脛病菌具有明顯的抑制活性，抑菌圈半徑分別為5.5和3 mm，隨后在活性追蹤的指導下，采用天然產物化學方法對其玉米發酵物的次生代謝產物進行研究，共分離鑒定了6個甲基苯酚類化合物和1個甲基環己酮二聚體。本文對這些化合物的來源、結構鑒定和抗菌活性進行報道。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

供試菌株 曲霉sp. HU0206由惠州學院生命科學學院徐良雄博士等分離自濱海鹽生植物老鼠艻()枝條，現保藏于惠州學院天然產物化學實驗室菌種庫；金黃色葡萄球菌()ATCC6538、大腸桿菌() K12-MG1655分別購自廣東省微生物菌種保藏中心和寶賽公司；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant)11646由廣州呼吸疾病研究所提供；馬鈴薯黑脛病菌()STB009、青枯病菌()STB020來自惠州學院天然產物化學實驗室。

試劑和儀器 二氯甲烷等分析純試劑(天津大茂)，色譜純甲醇(天津康科德)，氘代試劑(美國劍橋)，硫酸鏈霉素、鹽酸萬古霉素(上海麥克林生化科技)，甲氧西林(美國Glpbio)。SYNERGY H1全功能酶標儀(美國BioTek)，LC-16P高效液相色譜儀及LC- MS-8040電噴霧質譜儀(日本Shimadzu), Quantum-I核磁共振波譜儀(武漢中科牛津)，Bruker maXis超高分辨飛行時間質譜儀(德國Bruker)。

1.2 提取和分離

將活化好的菌株接種至30 mL PDB培養基, 在150 r/min、28 ℃黑暗中培養3 d，制得一級種子液，吸取1 mL接種至200 mL PDB培養基，相同條件培養3 d，得二級種子液，然后接種至200個玉米培養基發酵瓶中(每500 mL含60 g玉米和60 mL自來水)，28 ℃黑暗靜置培養28 d。

發酵物用95%乙醇浸提3次，每次24 h，濃縮去除乙醇并以石油醚脫脂后，以二氯甲烷萃取獲得抗金黃色葡萄球菌活性部位(80.0 g)，載樣量為200g，該部位對金黃色葡萄球菌的抑菌圈半徑為4 mm。該部位進行正相硅膠柱(100～200目，青島基億達)色譜，二氯甲烷-甲醇[100:0～50:50,/(下同)]梯度洗脫、合并得到流份Fr.1～Fr.12。Fr.4 (15.8 g)經凝膠柱(Sephadex LH-20, Amersham Biosciences)色譜，甲醇洗脫得到流份Fr.4-1～Fr.4-12。其中Fr.4-6經C18-反相硅膠柱(75m，日本富士硅化學)色譜純化，以甲醇-水(10:90)，洗脫得化合物7 (6.50 g); Fr.4-7(99.7 mg)經HPLC純化(C18柱, 5m, 10 mm× 250 mm, Shimadzu)，以甲醇-水(20:80)洗脫得化合物6 (R=37.5 min, 3.9 mg)；Fr.4-12 (105.7 mg)經HPLC純化，以甲醇-水(55:45)洗脫得化合物5 (R=11.5 min,4.0 mg)。流份Fr.6 (2.0 g)經C18-反相硅膠柱色譜, 甲醇-水(10:90～100:0)梯度洗脫得Fr.6-1～Fr.6-12，其中Fr.6-4 (62.3 mg)經HPLC純化，以甲醇-水(10:90)洗脫得化合物4 (R=7.4 min, 4.0 mg)；流份Fr.6-11 (445.7 mg)經HPLC純化，以甲醇-水(55:45)洗脫得化合物2 (R=13.0 min, 67.0 mg)、1 (R=32.5 min,5.0 mg)和3 (R=17.5 min, 11.0 mg) (圖1)。

1.3 抗細菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法[5]測定化合物的抑菌圈半徑，每濾紙片載樣量為40g，甲氧西林、硫酸鏈霉素和鹽酸萬古霉素為陽性對照(載樣量為20g),實驗設3個重復，結果取平均值。并采用微量稀釋法[6]測定活性化合物的最小抑制濃度(MIC)。

1.4 結構鑒定

化合物1 淺黃色粉末，根據HR-ESI-MS:411.1451 [M ? H]?(C23H23O7, 理論值為411.1449)推斷分子式為C23H24O7。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.46 (1H, d,= 1.2 Hz, H-6), 6.39 (1H, d,= 2.8 Hz, H-5″), 6.37 (1H, d,= 2.8 Hz, H-3′), 6.29 (1H, d,= 2.8 Hz, H-3″), 6.28 (1H, d,= 2.8 Hz, H- 5′), 5.82 (1H, d,= 1.2 Hz, H-4), 3.77 (3H, s, 4′-OCH3), 3.63 (3H, s, 2″-OCH3), 2.26 (3H, s, H-7″), 2.16 (3H, s, H-7), 1.81 (3H, s, H-7′);13C NMR (100 MHz,CD3OD):158.7 (C-4′), 151.4 (C-2′), 153.9 (C-2″), 152.3 (C-1), 152.0 (C-3), 148.2 (C-4′), 139.7 (C-1″), 136.5 (C-5), 134.9 (C-1′), 133.9 (C-6′), 130.8 (C-2), 126.9 (C-6″), 111.3 (C-6), 110.2 (C-5″), 107.7 (C-5′), 106.4 (C-4),101.3 (C-3′), 100.8 (C-3″), 56.0 (4′-OCH3), 55.8 (4′- OCH3), 21.6 (C-7), 16.4 (C-7′), 16.3 (C-7″)。

圖1 化合物1～7的結構

1H NMR譜顯示有6個苯環間位耦合質子[H5.82(1H, d,= 1.2 Hz, H-4), 6.46 (1H, d,= 1.2 Hz, H-6); 6.37 (1H, d,= 2.8 Hz, H-3′), 6.28 (1H, d,= 2.8 Hz, H-5′); 6.29 (1H, d,= 2.8 Hz, H-3″), 6.39 (1H, d,= 2.8 Hz, H-5″)]，2個甲氧基質子[H3.77 (3H, s, 4′- OCH3), 3.63 (3H, s, 2″-OCH3)]和3個單峰甲基質子[H2.16 (3H, s, H-7), 1.81 (3H, s, H-7′), 2.26 (3H, s, H-7″)]信號。13C NMR譜經HSQC歸屬后顯示23個碳信號，其中18個芳環碳(12個為季碳)、2個甲氧基碳(56.1, 55.8)和3個甲基碳(21.6, 16.4, 16.3)信號。上述信息提示該化合物由3個甲基苯酚單元組成。通過HMBC譜(圖2)對3個甲基苯酚單元的NMR數據進行歸屬，結果表明其甲基苯酚單元A和B的NMR信號，尤其13C NMR譜與5-methoxy-3,5′-dime- thyl-2,3′-oxybiphenyl-1,1′,2′-triol (2)[7]相近。而甲基苯酚單元C中的H3-7″和C-4″/5″/6″相關、H-3″/5″和C-1″相關、甲氧基質子(H3.63)與C-2″ (153.9)相關，且其NMR數據與文獻報道的1-methoxy-3,5′- dimethyl-2,3′-oxybiphenyl-5,1′,2′-triol[8]中對應單元的基本一致，確定該甲基苯酚單元C的取代情況與單元B相同，但甲氧基連在C-2″上，即為新的甲基苯酚三聚體(圖2)，命名為sydowiol F。

化合物2 淺黃色固體，HR-ESI-MS: 275.0929 [M ? H]?。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.30 (1H, d,= 1.2 Hz, H-4), 6.38 (1H, d,= 2.8 Hz, H-6′), 6.33 (1H, d,= 2.8 Hz, H-4′), 5.76 (1H, d,= 1.2 Hz, H-6), 3.77 (3H, s, 4′-OCH3);13C NMR (100 MHz,CD3OD):158.5 (C-4′), 151.7 (C-2′), 147.9 (C-3), 147.1 (C-3), 136.0 (C-1′), 133.9 (C-6′), 132.6 (C-2), 129.7 (C-5), 110.8 (C-4), 107.9 (C-5′), 106.6 (C-6), 101.3 (C-3′), 55.8 (4′-OCH3), 21.2 (C-7), 16.4 (C-7′)。以上數據與文獻[7]一致，故鑒定為5-methoxy-3,5′- dimethyl-2,3′-oxybiphenyl-1,1′,2′-triol。

圖2 化合物1的關鍵的HMBC (箭頭)相關

化合物3 白色固體，ESI-MS::271 [M ? H]?。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.57 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6′), 6.54 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2′), 6.46 (1H, d,= 2.2 Hz, H-4), 6.45 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2);13C NMR (100 MHz, CD3OD):165.2 (C-3′), 165.0 (C-7′), 163.5 (C-1′), 155.8 (C-3), 146.5 (C-5′), 146.1 (C-1), 143.3 (C-6), 132.5 (C-5), 116.6 (C-4), 114.7 (C-2), 113.4 (C-4′), 105.8 (C-2′), 105.7 (C-2), 21.3 (C-6′), 16.0 (C-7)。以上數據與文獻[9]一致，故鑒定為corynesidone A。

化合物4 白色針狀結晶，ESI-MS:125 [M + H]+, 247 [2M ? H]?。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.58 (1H, d,= 8.6 Hz, H-3), 6.52 (1H, d,= 2.6 Hz, H-6), 6.45 (1H, dd,= 8.6, 2.6 Hz, H-2), 2.12 (3H, s, H-7);13C NMR (100 MHz, CD3OD):151.0 (C-4), 149.3 (C-1), 126.5 (C-2), 118.4 (C-3), 116.3 (C-6), 113.8 (C-5), 16.4 (C-7)。以上數據與文獻[10～11]一致，故鑒定為鹿蹄草素。

化合物5 白色針狀結晶，ESI-MS:139 [M ? H]?。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.20 (1H, d,= 2.4 Hz, H-6), 6.16 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 2.15 (3H, s, H-7);13C NMR (100 MHz, CD3OD):153.1 (C-4), 144.0 (C-6), 134.3 (C-1), 127.2 (C-2), 112.1 (C-3), 102.0 (C-5), 15.3 (C-7)。以上數據與文獻[12]一致，故鑒定為3-羥基鹿蹄草素。

化合物6 白色粉末，ESI-MS:169 [M + H]+。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.73 (1H, d,= 2.8 Hz, H-6), 6.62 (1H, d,= 8.6 Hz, H-3), 6.58 (1H, dd,= 8.6, 2.8 Hz, H-2), 4.49 (2H, s, H-1′), 3.59 (2H, q,= 7.2 Hz, H-7), 1.23 (3H, t,= 6.8 Hz, H-2′);13C NMR (100 MHz, CD3OD):151.1 (C-1), 149.3 (C-4), 126.5 (C-5), 116.8 (C-6), 116.7 (C-3), 116.1 (C-2), 68.9 (C-7), 66.8 (C-1′), 15.4 (C-2′)。以上數據與文獻[13]一致，故鑒定為4-乙氧基-3-羥甲基苯酚。

化合物7 無定形粉末，比旋光([α]25 D+61.5,=1.6 mg/ml, CH3OH), ESI-MS:469 [2M + H]+, 233 [M ? H]?。1H NMR (400 MHz, CD3OD):6.96 (1H, dd,= 4.6, 9.9 Hz, H-3), 6.96 (1H, dd,= 4.6, 9.9 Hz, H-3′), 5.92 (1H, d,= 10.1 Hz, H-2), 5.89 (1H, d,= 10.1 Hz, H-2′), 4.48 (1H, dd,= 4.6, 9.4 Hz, H-4′), 4.47 (1H, dd,= 4.6, 9.4 Hz, H-4), 2.72～2.76 (2H, m, H-6), 2.72-2.76 (2H, m, H-6′), 2.04～2.12 (2H, m, H-5), 2.04～2.12 (2H, m, H-5′), 1.16 (3H, d,= 7.2 Hz, H-7′), 1.14 (3H, d,= 7.2 Hz, H-7);13C NMR (100 MHz, CD3OD):204.3 (C-1), 203.5 (C-1′), 155.9 (C-3′), 151.6 (C-3), 129.1 (C-2), 128.9 (C-2′), 67.9 (C-4′), 63.7 (C-4), 42.4 (C-5′), 39.6 (C-5), 41.2 (C-6′), 39.1 (C-6), 15.6 (C-7), 15.2 (C-7′)。以上數據與文獻[14]一致，故鑒定為epoxydine A。

1.5 抗細菌活性

化合物1～6的活性測試表明，載樣量為40g時所有化合物對大腸桿菌沒有顯示明顯的抑菌圈, 而化合物1～4分別對另外4株測試菌有較明顯和較微弱的抑制活性。微量稀釋法測試結果表明, 化合物1、2和4對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、黑脛病菌和青枯病菌抑菌效果較好，MIC為50或100g/mL，而化合物3的MIC> 400g/mL (表1)。

A: 抑菌圈半徑; B: 最小抑制濃度。

A: Radius of inhibition zone; B: Minimum inhibitory concentration (MIC).

2 結果和討論

非還原型聚酮合酶(NRPKSs)可催化生成芳環化合物，如苔色酸合酶催化1分子的乙酰輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A，經縮合、脫水、烯醇化、水解等反應生成含甲基的苯甲酸——苔色酸[15]。甲基苯酚類化合物1～6應是苔色酸經脫羧、羥基化和脫水縮合形成的衍生物，但本研究還在同一發酵物中發現了大量非芳環化合物甲基環己酮二聚體epoxydine A。最近Liu等[16]報道，生防真菌綠木霉()中水楊酸類似物Salicylaldehydes在被黃素依賴性酶VirI氧化成醌后，再由VirH進行環氧化修飾生成環己二酮，最后酮基被VirK和VirL還原成相應的醇，即環氧環己醇天然產物trichoxide。這曲霉HU0206代謝產物中的甲基環己酮類物質可能是通過聚酮合成途徑生成苔色酸及甲基苯酚類化合物后，繼續被修飾的產物。

活性測試表明，化合物1、2和4對多株測試細菌的活性較好，而所有化合物對大腸桿菌，以及其它化合物對所有5株測試細菌均未顯示明顯的拮抗活性。說明此類甲基苯酚類化合物對細菌具有拮抗特異性，芳環的羥基數量和取代位置對此類化合物的生物活性具有顯著影響。

本研究從植物內生曲霉HU0206發酵物中得到1個新甲基苯酚類三聚體，以及6個已知的甲基苯酚類和甲基環己酮類化合物，并對其生源關系和抗菌活性進行了研究和探討，初步闡明了該菌發酵物的抗菌物質基礎，豐富了曲霉屬真菌次生代謝產物的化學多樣性，對相關化合物的合成及活性研究具有一定的參考價值。

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Antibacterial Metabolites of Endophyticsp. HU0206 Isolated from

WANG Rui1, CHEN Shaowei2, YU Yanyan1, LI Chunxia1, YAO Songjin2, XU Liangxiong2*, TAO Jun1*

(1. School of Tropical Crops, Hainan University, Key Laboratory of Sustainable Utilization of Tropical Biological Resources of Hainan Province,Haikou 570228, China; 2. School of Life Sciences, Huizhou University,Huizhou 516007, Guangdong, China)

In order to explore the antibacterial metabolites of endophyticsp. HU0206, seven compounds were obtained from the corn fermentation of endophyticsp. HU0206 isolated fromusing chromatographic separation method. On the basis of spectral data, they were identified as six methylphenol derivatives, such as sydowiol F (1), 5-methoxy-3,5′-dimethyl-2,3′-oxybiphenyl-1,1′,2′-triol (2), corynesidone A (3), pyrolin (4), 3-hydroxylpyrolin (5), 4-ethoxy-3-hydroxymethylphenol (6), and a methylcy- clohexanone, epoxydine A (7).Compound 1 was a new compound. At the dose of 40g, compounds 1, 2 and 4 showed obvious antibacterial effects on, methicillin-resistant,andwith radius of inhibition zone≥2 mm, and minimum inhibitory concentrations (MICs) was 50 or 100g/mL. The radius of inhibition zone of compound 3 was1–2 mm for above bacteria with MIC higher than 400g/mL.However, all compounds did not inhibit the growth of.

Endophytic; Metabolite; Methylphenol;Methylcyclohexanone; Antibacterial activity

10.11926/jtsb.4646

2022-04-02

2022-06-15

國家自然科學基金項目(31772032)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31772032).

王瑞(1997年生)，男，碩士研究生。研究方向為微生物和植物互作機制。

. E-mail:taoj@hainanu.edu.cn; xlx048@hzu.edu.cn