清達顆粒通過p38 MAPK通路抑制大鼠高血壓心肌肥厚的作用機制研究※

王天一 祁江晗 張珊苑 何晨晨 褚劍鋒，2▲

心臟是高血壓最常見的靶器官損害之一，長期高血壓導致心肌細胞代償性增殖，間質細胞分泌增多[1-2]，導致心肌肥厚和間質纖維化，最終發生心室重構[3]。因此，降低血壓、抑制心肌肥厚的發生發展是防治高血壓心肌肥厚的有效途徑，是降低其他心血管疾病患病率和死亡率的關鍵所在。p38絲裂原活化蛋白激 酶（p-38 Mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調控細胞增殖與肥大[4]，充當“信息開關”的作用，對心肌肥厚有著非常重要的作用[5]。

清達顆粒由天麻、鉤藤、黃芩和蓮子心組成，全方共奏平肝潛陽、清泄心火的功效，是陳可冀院士臨床經驗方，主要用于治療新發1 級高血壓，臨床療效顯著。課題組前期研究發現，清達顆粒可以降低多種高血壓動物模型的血壓，在改善高血壓導致的心肌肥厚及心肌纖維化，抑制心室重構等方面療效顯著[6-9]，但具體機制尚未闡明。本實驗評估了清達顆粒對自發性高血壓大鼠血壓、心臟收縮功能和形態學、心臟重量指數、心肌肥厚指標的影響，驗證了清達顆粒通過p38 MAPK 通路抑制高血壓心肌肥厚的機制，為清達顆粒降低血壓、改善心肌肥厚提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物12 只5 w 齡無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級雄性自發性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat，SHR），6 只同周齡正常血壓（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購入，動物許可證號為SCXK（京）2019-0009。動物飼養于福建中醫藥大學醫學實驗動物中心[SYXK（閩）2009-0001]，自由進食、飲水，飼養溫度與相對濕度恒定，晝夜交替時間各為12 h。

1.2 藥品與試劑清達顆粒由江陰天江藥業提供（批號：1704306）；蘇木素染色液（批號：G1140）、伊紅染色液（批號：G1100）購買于北京索萊寶科技有限公司；異氟烷（批號：970-00026-00）購買于深圳瑞沃德生命科技有限公司；組織總RNA 提取試劑盒（批號：RE-03011）、逆轉錄試劑盒（批號：RT-01021）、qRTPCR 試劑盒（批號：QP-01011）購買于FOREGENE 公司；ANP 抗體（批號：PA5-79758）、BNP 抗體（批號：PA5-96084）、BCA 蛋白定量分析試劑盒（批號：23227）購買于美國Thermo Fisher Scientific 公司；pp38 MAPK 抗體（批號：4511S）、p38 MAPK（批號：8690S）、羊抗兔二抗（批號：7074S）購買于美國 CST 公司；GAPDH 抗體（批號：10494-1-AP）購買于美國Proteintech 公司；其他試劑購買于上海碧云天及美國MCE公司。

1.3 儀器Kent Scinetific CODA 八通道無創血壓測量儀（美國Kent Scientific公司）；Vero2100超高分辨率小動物彩色超聲多普勒成像系統（加拿大Visual Sonics 公司）；生物自動脫水儀及石蠟包埋機（湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司）；全自動石蠟切片機（德國Leica 公司）；Nanodrop One 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DM4000B顯微鏡（德國Leica 公司）；ChemiDoc MP Bio-Rad 凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；7500 Real time-PCR 儀（美國 ABI公司）。

1.4 動物分組與給藥適應性喂養1 w 后，將自發性高血壓大鼠隨機分為模型組（SHR 組）和清達顆粒組（SHR+QDG組），每組6只；6只同周齡WKY大鼠作為對照組（WKY 組）。清達顆粒組按照0.9 g/（kg·d）將清達顆粒加入一定比例生理鹽水溶解，給予灌胃給藥；對照組和模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續8 w。

1.5 無創尾動脈加壓法測量血壓每周固定同一時間，采用無創尾動脈加壓法測量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態下尾動脈的收縮壓（Systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（Diastolic blood pressure，DBP）和平均動脈壓（Mean arterial pressure，MAP），連續監測8 w。

1.6 超聲心動圖檢測末次給藥后，剔除胸部毛發，異氟烷吸入麻醉，采用Vero 2100 成像系統檢測大鼠心臟收縮功能變化。將探頭置于大鼠胸骨左緣，通過M 型心動圖測量關鍵指標，計算左心室射血分數（left ventricle ejection fractions，LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricle fractional shortening，LVFS），取連續3 個周期測量的平均值作為最終結果。

1.7 心臟重量指數計算經腹主動脈取血后取出大鼠心臟，切除心耳，清洗干凈后，水平方向橫切為三部分，中間部分置于4%多聚甲醛固定液中，心尖部分置于-80 ℃超低溫冰箱保存。稱量大鼠體重（body weight，BW），測量大鼠脛骨長度（tibial length，TL），計算得出大鼠心臟重量指數（Heart Weight Index，HWI）。計算公式：HWI=BW/TL。

1.8 HE 染色實驗48 h 后，將放置于4%的多聚甲醛固定液中的心臟組織，經脫水包埋后，采用全自動石蠟切片機制備4 μm石蠟切片，將切片脫蠟，用于蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后在顯微鏡下拍攝。

1.9 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantititive reverse transcription，qRT-PCR）檢測心臟組織心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）、腦利鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）的mRNA 表達提取各組大鼠心臟組織mRNA，逆轉錄純化的mRNA，合成cDNA。根據說明書進行qRT-PCR 分析。以GAPDH 為內參，引物序列見表1。采用2-ΔCt相對定量方法進行數據分析：ΔCt(實驗組/對照組)=Ct(實驗組/對照組目標基因)-Ct(實驗組/對照組內參基因)。

表1 mRNA引物序列

1.10 Western Blot 檢測心臟組織ANP、BNP、p38 MPAK 以及p-p38 MPAK 蛋白的表達取出-80 ℃保存的心臟組織，每100 mg 加入1 mL Werstern 及IP裂解液（裂解液中含有1×Cocktail、1×Phosstop 和10×PMSF），震蕩渦旋、裂解、離心后，取上清液，采用BCA法定量蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠，固定于電泳槽中，恒壓90 v，30 min；120 v，1 h 進行電泳。將凝膠放入轉膜夾，在轉膜槽中恒壓110 V轉膜。封閉后按照說明書稀釋比例分別孵育一抗（ANP、BNP、p38 MPAK、p-p38 MPAK）、羊抗兔二抗后，使用Image Lab凝膠成像系統進行曝光，應用Image J 軟件進行定量分析。

1.11 統計學方法采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據處理，所有數值均表示為平均值±標準差（±s），兩組比較時，首先判斷是否符合正態分布，符合時采用t檢驗；三組比較時，同樣先判斷是否符合正態分布，符合時采用單因素方差分析。不符合正態分布時，采用非參數檢驗。P＜0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 清達顆粒對自發性高血壓大鼠血壓和體重的影響每周血壓監測發現，與WKY 組相比，SHR 組SBP、DBP 和MAP 均顯著升高（P＜0.05）。給藥第3 w開始，與SHR 組相比，SHR+QDG 組SBP、DBP 和MAP均顯著降低（P＜0.05）。同時，每周稱量體重發現清達顆粒對大鼠體重無明顯影響（P＞0.05）。結果表明，清達顆粒降低自發性高血壓大鼠血壓且對體重無影響。見圖1。

圖1 清達顆粒對自發性高血壓大鼠血壓和體重的影響

2.2 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟重量指數的影響計算各組大鼠心臟重量指數，即心臟重量與脛骨長度的比值。與WKY 組相比，SHR 組心臟重量指數顯著升高（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組心臟重量指數顯著降低（P＜0.05）。結果表明，清達顆粒可以降低自發性高血壓大鼠心臟重量指數。見圖2。

圖2 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟重量指數的影響

2.3 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟收縮功能的影響灌胃8 w 后，超聲心動圖顯示，與WKY 組相比，SHR組射血分數、短軸縮短率顯著降低（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組可以顯著抑制射血分數、短軸縮短率的降低（P＜0.05）。結果表明，清達顆粒可以改善自發性高血壓大鼠心臟收縮功能。見圖3。

2.4 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織病理變化的影響心臟組織HE染色可發現，WKY組大鼠心肌纖維排列整齊；SHR 組心肌纖維增粗腫脹、排列紊亂，心肌細胞束出現溶解斷裂、炎性細胞浸潤；SHR+QDG組可顯著改善上述病理形態改變。結果表明，清達顆粒可以改善自發性高血壓大鼠心臟病理形態的變化。見圖4。

2.5 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP 的mRNA 及蛋白表達的影響經qRT-PCR 和Westren Blot 檢測心臟組織ANP、BNP 的表達發現，與WKY 組相比，SHR 組心臟組織ANP、BNP 的mRNA 和蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與SHR 組相比，SHR+QDG組可顯著降低ANP、BNP的mRNA和蛋白水平的表達（P＜0.05）。結果表明，清達顆粒可以降低心肌肥厚基因ANP、BNP 的mRNA 和蛋白的表達。見圖5-1及圖5-2。

圖5-1 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP mRNA的影響

圖5-2 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP 蛋白表達的影響

2.6 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織p38 MAPK 通路相關蛋白表達的影響與WKY 組相比，SHR 組p-p38/p38 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組p-p38/p38蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。結果表明，清達顆粒可以抑制自發性高血壓大鼠心臟p38 MAPK 通路相關蛋白的活化。見圖6。

圖6 清達顆粒對自發性高血壓大鼠心臟組織p38 MAPK通路相關蛋白表達的影響

3 討論

現代醫學研究表明，高血壓心臟病的特點是以心肌細胞的肥大和間質細胞的增殖為主，不僅使心肌細胞面積增大，而且激活肥厚基因，是心血管事件的獨立危險因素[10-12]。心肌肥厚特異性因子ANP是心肌細胞肥厚的反應指標[13]，在SHR心臟組織ANP的mRNA表達較WKY顯著升高，并且隨高血壓的發生、發展而相應增加[14]，同時，胚胎基因BNP 的表達在心肌肥厚過程中也明顯增加[15]。本實驗發現，清達顆粒可顯著降低心臟組織ANP、BNP 的mRNA 和蛋白的表達，改善心臟功能及心臟組織病理變化，提示清達顆粒可以抑制自發性高血壓大鼠心肌肥厚。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調控細胞增殖與肥大[4]。p38 MAPK作為MAPK家族的主要成員，參與細胞增殖和凋亡、心肌肥厚及能量代謝等[16]，在應激刺激引起的心肌細胞肥大中具有重要作用[17]。一方面，活化的p38 MAPK 激活下游細胞質蛋白和轉錄因子進而介導肥大信號轉導；另一方面，p38 MAPK 的激活直接導致心肌肥厚標志物如ANP、BNP 啟動子的活化。Wu 等[18]發現減弱p38 MAPK 的激活可以改善壓力超負荷引起的心臟重構和心臟功能；Hui等[19]發現抑制p38 MAPK可顯著改善病理性心肌肥厚；血管緊張素Ⅱ干預的大鼠心肌細胞肥厚模型中，抑制p38 MAPK 信號通路可以抑制心肌肥厚標志物的表達水平，改善心肌肥厚[20]。

前期研究發現，清達顆粒對多種高血壓動物模型作用顯著，既可以降低血壓，又可以保護高血壓導致的靶器官損害，在改善高血壓導致的心肌肥厚及心肌纖維化，抑制心室重構等方面療效顯著[6-9]。多次重復體內實驗發現清達顆粒以0.9 g/（kg·d）的給藥劑量時，對自發性高血壓大鼠的降壓效果最為顯著[21-22]，因而本次實驗選擇0.9g/（kg·d）的給藥劑量。本實驗通過Western Blot 驗證了清達顆粒對p38 MAPK 通路相關蛋白活化的影響，結果發現，清達顆粒可以顯著降低心臟組織p-p38/p38 的表達，抑制p38 MAPK 通路的活化，初步驗證了清達顆粒通過p38 MAPK 通路抑制高血壓心肌肥厚的機制。