基于生物信息學數(shù)據(jù)庫分析FOXM1 在肝癌中的表達及其臨床預(yù)后意義

蘇永發(fā)，陳金圖

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科，福建 泉州 362000）

肝癌是全球常見的惡性實體腫瘤之一，在我國存在高發(fā)病率和致死率[1-2]。肝癌起病隱匿，術(shù)后總體預(yù)后差[3-4]。其發(fā)生發(fā)展機制十分復雜,至今仍未明確,因此探索新的、有價值的腫瘤標志物對肝癌的診療及預(yù)后具有重要意義。

FOXM1 是屬于Fox 家族的一種轉(zhuǎn)錄因子亞型，其表達及轉(zhuǎn)錄依賴于細胞周期分化過程[5]。FOXM1 能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞一系列病理活動，包括增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移，因此FOXM1 的表達水平將為腫瘤的診斷和預(yù)后提供重要的指標[6-7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 在癌癥，如宮頸癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10-12]、膀胱癌[13-14]等中異常高表達，逐漸成為腫瘤研究的熱點，然而關(guān)于FOXM1 在肝細胞癌的研究較少。本研究主要采用生物信息的方法，挖掘分析Oncomine、GEPIA 和HPA 公共數(shù)據(jù)庫中FOXM1在肝癌中的表達情況及其潛在的臨床預(yù)后意義。另外，最近的大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，靶向的FOXM1抑制劑具有有效的抗癌作用，表明FOXM1 將有機會為抗癌藥物開發(fā)和腫瘤治療提供潛在的新靶標[15]。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫的在線分析 Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/）是采用基因芯片技術(shù)建立的腫瘤數(shù)據(jù)庫[16]，其中一項重要功能就是進行腫瘤和正常組織的基因差異表達分析。本研究預(yù)設(shè)的檢索條件如下：（1）目的基因: FOXM1；（2）分析類別：癌癥組vs 正常組；（3）腫瘤類型：肝癌；（4）數(shù)據(jù)類型: mRNA；（5）樣本類型：臨床標本；（6）數(shù)據(jù)集篩選標準：P ＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。將所有結(jié)果匯總進行綜合比較分析。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫的在線分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一個可用于整合分析癌癥表達譜數(shù)據(jù)的交互式分析網(wǎng)站[17]。本研究預(yù)設(shè)的檢索條件如下：（1）“Expression DIY” 模塊：Boxplot 中選擇FOXM1 及Match TCGA normal data and GTEx data；Stage plot 中選擇FOXM1、“Yes”Log Scale（2）“Survival”模塊：Survival Plots 中選擇FOXM1、Overall Survival 或Disease Free Survival；（3）“Correlation”模塊：選擇FOXM1 分別與MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等DNA 修復基因及PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A 和VEGFA等PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子進行相關(guān)性分析。

1.3 HPA 數(shù)據(jù)庫分析FOXM1 蛋白表達差異 HPA在線網(wǎng)站（https://www.proteinatlas.org/）是一個利用各種組學和技術(shù)整合人體不同組織和器官的蛋白質(zhì)表達圖譜的網(wǎng)站[18]。本研究主要利用該網(wǎng)站分析FOXM1 在肝癌及肝正常組織的免疫組織化學染色情況及差異表達信息。

1.4 WB 進行相關(guān)蛋白驗證 采用Western blot 檢測FOXM1 過表達HepG2 細胞株錯配修復基因及PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達水平，進一步驗證生物信息學數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用t 檢驗分析肝癌組與正常組中FOXM1 基因表達差異，采用單因素方差分析方法進行不同臨床階段之間FOXM1 基因表達的比較，采用皮爾森統(tǒng)計方法對相關(guān)性進行分析，繪制Kaplan-Meier 曲線進行預(yù)后分析，P＜0.001 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腫瘤類型FOXM1 基因的表達情況 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中共提供455 項FOXM1 基因在不同類型腫瘤的數(shù)據(jù)集。其中FOXM1 表達差異有統(tǒng)計學意義的研究結(jié)果共有78 個，F(xiàn)OXM1 表達增高的研究有75 個，降低的僅有3 個。在常見的惡性腫瘤中，F(xiàn)OXM1 在肺癌的研究結(jié)果中高表達有11個，在乳腺癌和淋巴瘤的研究高表達各有8 個，結(jié)直腸癌的研究中高表達有6 個，在子宮頸癌的研究中高表達有4 個，在胰腺癌和胃癌的研究中高表達各有2 個，其中高表達于肝癌中的研究有4個。從圖中我們還可以得到，Oncomine 數(shù)據(jù)庫目前收集到的FOXM1 基因低表達的研究僅有3 個，均存在于白血病中，見圖1。

圖1 FOXM1 基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫所有腫瘤研究中的表達

2.2 肝癌中FOXM1 基因的表達情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫顯示自2002 年至今的研究中，其中有4 個子數(shù)據(jù)集對肝癌組與正常組進行分析，共760 例標本，見圖2。對上述4 個數(shù)據(jù)集結(jié)果進行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝臟組織比較，F(xiàn)OXM1 基因在所有差異表達基因中的中位秩為272.5，P 值為1.18E-7，其差異顯著，說明FOXM1 高表達于肝癌中。

圖2 FOXM1 基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫肝癌中的表達

2.3 不同肝癌研究中FOXM1 基因的表達情況 獲取Oncomine 數(shù)據(jù)庫中不同肝癌數(shù)據(jù)集與肝臟正常組織FOXM1 基因的表達數(shù)據(jù)，對相關(guān)數(shù)據(jù)作箱式圖對比分析。FOXM1 mRNA 高表達于肝癌中（P均＜0.001），見圖3。GEPIA 數(shù)據(jù)庫中共檢索到369例肝癌及160 例正常肝臟組織，包含F(xiàn)OXM1 mRNA 的表達含量信息，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，GEPIA數(shù)據(jù)集分析結(jié)果與Oncomine 數(shù)據(jù)庫相一致（P＜0.001），見圖4。

圖3 Oncomine 數(shù)據(jù)庫FOXM1在不同肝癌研究數(shù)據(jù)集中的表達

圖4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫FOXM1 在肝癌與正常組織中的表達差異

應(yīng)用HPA 數(shù)據(jù)庫在線分析了肝癌組織和正常組織FOXM1 的蛋白表達情況，驗證蛋白與mRNA的表達差異水平是否一致。結(jié)果顯示FOXM1 蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，該蛋白染色結(jié)果與mRNA 表達一致。見圖5。

圖5 FOXM1 蛋白在肝癌組織及正常組織間的表達差異。A為正常肝組織FOXM1 蛋白表達；B 為肝癌組織中FOXM1 蛋白表達

2.4 FOXM1 基因表達水平與肝癌臨床病理分期的關(guān)系 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中分析FOXM1 基因表達與肝癌臨床病理分期的關(guān)系，結(jié)果顯示在不同的腫瘤臨床分期各組間FOXM1 mRNA 表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖6。

圖6 GEPIA 數(shù)據(jù)庫FOXM1 基因在不同肝癌分期中的表達情況

2.5 FOXM1 基因表達水平與肝癌患者生存期的關(guān)系 從GEPIA 數(shù)據(jù)庫獲得364 例肝癌患者資料信息，進行Kaplan-Meier 生存曲線分析，其結(jié)果顯示FOXM1 mRNA 表達水平對肝癌患者的總生存期和無瘤生存期均存在顯著影響。FOXM1 高表達組患者比低表達組明顯縮短（P 均<0,001）,見圖7。

圖7 GEPIA 數(shù)據(jù)庫FOXM1 表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 FOXM1 基因表達量與錯配修復基因表達的相關(guān)性 為探索FOXM1 在肝癌中的表達及影響臨床預(yù)后的潛在分子機制，本文利用TCGA 數(shù)據(jù)分析對FOXM1 基因表達情況與MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等一系列錯配修復基因的表達進行Pearson 相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)FOXM1與MSH4 相關(guān)性低，而與MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表達呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P均＜0.001），見圖8A，其中與MSH2 和MSH6 相關(guān)性尤為顯著。

圖8 GEPIA 數(shù)據(jù)庫FOXM1 表達與錯配修復基因及PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子表達的相關(guān)性。

2.7 FOXM1 與PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子在肝癌中的表達相關(guān)性 采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性分析功能，分析在肝癌中FOXM1 與PI3K/AKT 信號通路的關(guān)聯(lián)程度。皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在肝癌組織中FOXM1 基因的表達與PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A 及VEGFA 的表達均呈現(xiàn)正相關(guān)（P 均＜0.001），見圖8B。

2.8 WB 驗證FOXM1 過表達株中錯配修復基因與PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達情況 本研究小組成功構(gòu)建FOXM1 過表達HepG2 細胞株見圖9A。采用Western Blot 進行蛋白檢測。實驗結(jié)果顯示，相較于正常組，過表達組MLH1、MSH2、MSH3、MSH5、MSH6、PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A和VEGFA 的表達水平在一定程度上有所提高，該結(jié)果與生物信息學分析結(jié)果相互驗證。

圖9 過表達FOXM1 HepG2 細胞株相關(guān)蛋白表達情況。注：A 為成供構(gòu)建FOXM1 過表達株FOXM1 的表達水平；B 顯示錯配修復基因蛋白表達水平；C 顯示PI3K/AKT 信號通路關(guān)鍵蛋白表達水平。

3 討論

大量臨床研究顯示FOXM1 是具有細胞增殖特異性的腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過檢索大型癌癥公共數(shù)據(jù)庫中肝癌組織FOXM1 的表達數(shù)據(jù)，深度挖掘分析了FOXM1 在肝癌中的表達水平及其臨床預(yù)后意義。Oncomine 和GEPIA 的數(shù)據(jù)均顯示了FOXM1 基因在肝癌中的表達水平明顯高于正常組織。HPA 在線檢索網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 在肝癌中的蛋白表達水平呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，該結(jié)果與上述兩個數(shù)據(jù)庫FOXM1 mRNA 分析結(jié)果相互驗證。本研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 與肝癌患者臨床預(yù)后密切相關(guān)。這一結(jié)果與Zhao 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)存在相似之處。大量研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 在腫瘤化療耐藥中起著至關(guān)重要的作用。Zhou 等[12]研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在卵巢癌耐藥標本中高表達，增強卵巢癌細胞對化療藥物順鉑的耐藥性；Okada 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在接受化療治療的晚期胃癌患者中FOXM1 過表達與多西紫杉醇耐藥性顯著相關(guān)。Liu 等[20]發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中FOXM1 的陽性表達率與順鉑敏感性和預(yù)后不良有關(guān)，提示FoxM1 在順鉑耐藥中起關(guān)鍵作用。本研究驗證了FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子表達水平與肝癌臨床分期的關(guān)系。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)有顯著差異。后續(xù)研究中，可以對其進一步展開探究。

肝癌是由遺傳和環(huán)境因素引起的復雜疾病。基因組不穩(wěn)定是其發(fā)生的關(guān)鍵性因素之一。錯配修復基因（Mismatch repair，MMR）是一組遺傳相關(guān)基因，任意一個基因突變，將影響DNA 堿基錯配修復功能，引發(fā)腫瘤。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫相關(guān)性分析功能，本研究對FOXM1 分別與MSH2 等錯配基因一一進行分析驗證，發(fā)現(xiàn)與MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表達呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。PI3K/AKT 信號通路參與調(diào)節(jié)細胞增殖分化。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫相關(guān)性分析功能，本研究分析了肝癌中FOXM1 與PI3K/AKT 通路關(guān)鍵性分子的表達相關(guān)性，為后續(xù)腫瘤發(fā)生分子機制的探究提供參考依據(jù)。本研究使用大型癌癥數(shù)據(jù)庫分析了FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子在HCC 中的表達及其臨床預(yù)后意義及其相關(guān)分子機制，探索其作為肝癌預(yù)后的新標志物和基因治療靶標的潛能。大量研究證明，單一的腫瘤標志物無法及時、有效地輔助腫瘤診斷。本研究小組后期將聯(lián)合FOXM1、AFP、GP73 及DCP 等肝癌輔助診斷項目，進一步探尋更為有效的腫瘤標志物組合，幫助臨床實現(xiàn)早期診斷與治療。