基于BDNF-SYN 軸探討功能性電刺激對腦梗死大鼠學習記憶能力及認知能力的作用

胡琪苓，魏艷霞，賈東佩，汪寧，張輝

（1.南陽市中心醫院康復醫學科，河南 南陽 473000；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450000）

腦梗死主要由動脈粥樣硬化及高血壓小動脈硬化導致，引發血管病變，血液成分改變，病死率約10%～15%，致殘率極高且易復發[1]。腦源性神經營養因子（BDNF）是人腦中與空間學習相關的重要物質，神經營養因子中的一種，存在于人的神經系統中，由BDNF 基因合成[2]。突觸素（SYN）是一種完整的膜糖蛋白，主要分布于大腦、脊髓、視網膜的突觸前小泡，也出現在腎上腺髓質小泡及神經肌肉連接點，參與突觸囊泡的形成和胞吐[3]。BDNF-SYN 軸在神經系統的發育、分化及突觸可塑性中發揮重要作用[4]。腦梗死目前主要依靠藥物進行降壓、溶栓治療，但預后較差，患者常有中樞神經系統異常引起的后遺癥[5-6]。功能性電刺激通過低頻脈沖電流刺激神經肌肉，同時刺激傳入神經，將重復的運動信息傳入中樞神經系統，在大腦皮層形成興奮痕跡，逐漸恢復原有的運動功能，進行功能重建[7-8]，但在體內作用機制尚不明確。本研究通過閉塞大腦中動脈構建大鼠腦梗死模型，觀察功能性電刺激對腦梗死大鼠學習記憶及認知能力的影響，并初步探討其調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，60 只，5 周齡，體質量250～350 g，購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（魯）2016-0001。

1.1.2 藥物、試劑 10%水合氯醛（西安眾森醫藥有限公司）、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、SYBR Green 預混染料，反轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司），兔抗鼠BDNF、SYN 抗體（美國Abcam 公司），ECL 發光試劑盒（美國Biorad 公司），蛋白定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 LC480 熒光定量PCR 儀（美國Roche公司），電泳系統（上海天能生命科技有限公司），Nano drop 2000 紫外分光光度計（美國Thermo Fisher 公司），化學發光成像儀（美國Bio-rad 公司），腦立體定位儀（美國stoelting 公司），CM1850切片機（日本Lecia 公司），E600 顯微鏡（日本尼康公司），Morris 水迷宮實驗系統（北京眾實迪創有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 60 只大鼠隨機分為3 組，每組20只：假手術組（假手術+安慰刺激）[9]、對照組（腦梗死模型+安慰刺激）、電刺激組（腦梗死模型+功能性電刺激）。安慰刺激及功能性電刺激均通過治療儀將電極置于前肢肌群，但安慰刺激組不連接電流，功能性電刺激組通過一定頻率及強度電流刺激肌肉群。

1.2.2 模型制備 各組大鼠適應性喂養一周后，通過大鼠大腦中動脈閉塞法構建大鼠腦梗死模型。對照組、電刺激組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛4 mL/Kg，麻醉后頸部備皮消毒，于頸部正中切開，切口長度約3 cm，分離頸部腺體組織后，沿肌肉紋理肌肉及筋膜，分離左頸總動脈（CCA）表面血管組織，暴露CCA，沿CCA 向上分離，于甲狀腺水平處找到頸外動脈（ECA）及頸內動脈（ICA），結扎CCA近端及ECA，微動脈夾短暫夾閉ICA 遠端，離CCA分叉5 mm 處剪出切口，線栓插入后于切口處稍微結扎，松開動脈夾，線栓緩慢插入ICA，于切口處稍微打結防止滑脫，至有阻力停止，深度約20 mm，線栓至大腦中動脈起始部位，固定線栓后，縫合手術切口，90 min 后拔出線栓。術后大鼠注意保暖，肛溫保持37 ℃，連續一周腹腔注射青霉素3 萬單位/d。假手術組大鼠麻醉后僅分離血管，不插入線栓，其他操作相同。

手術清醒后，參照Longa 法[10]進行模型制備評分，1～3 分為造模成功，具體評分如下：0 分,無神經損傷癥狀;1 分,輕微神經損傷,左側前爪伸展困難;2 分,中度神經功能損傷,中度局灶性病變，向左轉圈;3 分,重度局灶性病變，神經功能損傷嚴重,向左傾倒;4 分,不能自主行走,精神意識嚴重缺失。

1.2.3 功能性電刺激干預 術后7 d，電刺激組采用治療儀（Neuro Continence，英國Verity Medical 公司）對大鼠雙側前肢進行電刺激，每日兩次，每次10 min，治療周期21 d。大鼠俯臥固定后，電極分別置于前肢肌群近遠端，刺激雙側前肢肌肉收縮，以產生伸腕伸指動作為準。頻率100 Hz，脈寬250 μs，強度3～6 mA，電流通斷比4 s∶6 s。假手術組、對照組接通相應的電極，不給電流刺激。

1.2.4 改良神經功能缺陷程度評分(mNSS)[11]分別于術后1、7、14、21、28 d 通過各組大鼠mNSS 評分，評估大鼠神經功能損傷情況。mNSS 評分主要包括運動實驗、感覺實驗、反射喪失和不正常運動、癲病及肌陣攣、肌張力障礙幾項內容，總分18分，分數越高，神經功能損傷越嚴重，具體分級如下：13～18 分為嚴重損傷；7～12 分為中度損傷；1～6分為輕度損傷。

1.2.5 大鼠水迷宮實驗 術后第28 d 開始水迷宮實驗評估，前五天（D1、D2、D3、D4、D5）進行定位航行實驗，第6 天進行空間探索實驗。定位航行實驗：每日固定時間點將大鼠分別從4 個象限放入水池，面部面向池體，記錄大鼠爬上平臺時間即為逃避潛伏期。若120 s 內未找到平臺，則逃避潛伏期記為120 s。每日4 次，記平均值為當天測量結果。空間探索實驗：第6 天撤去平臺，于平臺所在象限的對角象限面向池壁放入大鼠，記錄2 min 內大鼠穿越平臺次數，并分析大鼠在原平臺象限所占時間及路程。

1.2.6 腦皮層梗死區病理學改變 行為學實驗結束后，處死大鼠取腦組織，部分液氮凍存用于基因及蛋白含量檢測，部分用于HE 染色。4%多聚甲醛固定72 h 后，PBS 沖洗干凈，梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續5 μm 切片。常規蘇木精-伊紅染色，蒸餾水沖洗，梯度酒精水化，二甲苯脫蠟，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察腦皮質梗死區的病理變化。

1.2.7 腦皮層中BDNF、SYN mRNA 表達量檢測取大鼠腦組織，勻漿儀研磨后，加入Trizol 提取組織總RNA，電泳鑒定結構后，測量RNA 含量，通過逆轉錄試劑盒反轉成穩定cDNA 結構。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）反應體系：SYBR Premix Ex Taq 13 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 8.5 μL；反應條件：95℃預變性8 min；94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，重復45 個循環。GAPDH 為管家基因，通過2-△△CT法計算BDNF、SYN mRNA 相對表達量，上下游引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.2.8 腦皮層中BDNF、SYN 蛋白表達量 取約100 mg 腦組織，加入RIPA 裂解液，液氮研磨后，10 000 r/min 4℃離心15 min，棄去沉淀，取上清。用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白含量。配制分離膠與濃縮膠后，取50 μL 蛋白樣品等量加入上樣緩沖液，98℃水浴3 min，用于蛋白電泳實驗。電泳結束后濕轉90 min，取PVDF 膜脫脂奶粉封閉2.5 h，加入稀釋一抗（1∶8 000）4℃搖床孵育過夜，加入酶標二抗（1∶1 000 稀釋），常溫搖床孵育2 h，沖洗后加入根據ECL 顯色試劑盒加入工作液，放入成像儀中曝光，將BDNF、SYN 與GAPDH 灰度值相比后計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據，計量資料均以（）描述，重復計量資料比較采用重復測量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗；多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組mNSS 評分比較 與假手術組相比，對照組及電刺激組術后1、7、14、21、28 d mNSS 評分均升高（P＜0.05），其中電刺激組術后14、21、28 d mNSS評分低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠mNSS 評分比較

2.2 Morris 水迷宮實驗評估學習記憶能力 與假手術組相比，對照組、電刺激組逃避潛伏期增加（P＜0.05），其中電刺激組逃避潛伏期均低于對照組（P＜0.05）。與假手術組相比，對照組、電刺激組原平臺象限所占時間及路程降低，穿越平臺次數減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中電刺激組原平臺象限所占時間及路程、穿越平臺次數均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3-4。

表3 各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較（s，n=20）

表4 各組大鼠空間探索實驗結果比較（n=20）

2.3 腦皮層梗死區病理學改變（HE）假手術組腦組織神經細胞排列規則，結構清晰，形態正常，對照組神經細胞排列疏松紊亂，胞核皺縮溶解，形成深藍密質塊，細胞數量大面積減少，梗死區腦組織著色較淺，色差明顯，電刺激組神經細胞部分排列紊亂，梗死面積縮小，部分胞核縮小，相比對照組腦皮質層損傷明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮質層病理學改變（HE×400）

2.4 各組大鼠腦皮層中BDNF、SYN mRNA 相對表達量 與假手術組相比，對照組、電刺激組BDNF、SYN mRNA 相對表達量降低（P＜0.05），其中電刺激組BDNF、SYN mRNA 相對表達量高于對照組（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠BDNF、SYN mRNA 相對表達量比較

2.5 各組大鼠腦皮層中BDNF、SYN 蛋白相對表達量 與假手術組相比，對照組、電刺激組BDNF、SYN 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），其中電刺激組BDNF、SYN 蛋白相對表達量高于對照組（P＜0.05），見表6、圖2。

圖2 各組Western blot 蛋白條帶圖

表6 各組大鼠BDNF、SYN 蛋白相對表達量比較

3 討論

腦梗死臨床主要表現為偏身感覺障礙、共濟失調、感覺異常等腦功能缺損綜合征，研究表明腦梗死大鼠空間辨別能力下降，記憶能力減退并且學習能力退化[12]。BDNF-SYN 軸通過調控軸突及樹突的生長及結構，調節中樞神經系統的可塑性及生長發育，從而對大腦的空間認知及學習能力產生重要影響[13]。功能性電刺激常用于運動神經元癱瘓、呼吸功能障礙等疾病，可以誘導肌肉非自主運動，從而恢復肌群運動能力[14]。研究表明[15-16]功能性電刺激可以增強腦卒中神經干細胞分化增殖，提高成纖維生長因子表達，改善大腦損傷，恢復肌肉群運動及平衡能力。目前功能性電刺激在腦梗死大鼠中的作用機制仍不明確，本研究通過探討BDNF-SYN 軸闡述功能性電刺激修復腦梗死損傷的機制，為進一步闡明功能性電刺激在腦梗死大鼠中的作用機理奠定基礎。

本研究發現，對照組及電刺激組術后1、7、14、21、28 d mNSS 評分均比假手術組升高，其中電刺激組14、21、28 d mNSS 評價均低于對照組。這提示造模后大鼠神經功能缺損，感覺遲緩，運動功能失常，功能性電刺激可以緩解神經損傷，改善腦梗死大鼠運動及反射功能。研究表明[17]功能性電刺激可以通過低頻電刺激實現肌肉非自主運動，改善卒中后上肢肢運動功能。水迷宮結果顯示，與假手術組相比，對照組及電刺激組逃避潛伏期延長、原平臺所占時間及路程縮短、穿越平臺次數減少，其中電刺激組原平臺象限所占時間及路程、穿越平臺次數均高于對照組，逃避潛伏期短于對照組，提示大鼠造模后空間認知能力、學習記憶能力均下降，功能性電刺激可能通過增加BDNF、SYN 的表達，在一定程度上恢復腦部損傷，改善腦梗死大鼠行為能力。有報道[18]顯示功能性電刺激可以通過調控BDNF-SYN 軸激活鈣信號傳導，促進突起分化，增強神經元連接及突觸傳遞，從而提高腦部海馬區學習記憶能力。病理結果顯示對照組神經細胞數量減少，排列雜亂，提示中動脈閉塞引起腦部梗死。電刺激組梗死面積明顯減少，損傷明顯改善。功能性電刺激可以修復梗死區域，改善細胞結構，減輕病理損傷。有報道[19]顯示功能性電刺激可以增加細胞骨架蛋白表達，提高神經元細胞修復功能，促進病理損傷恢復。

本研究中，對照組、電刺激組BDNF、SYN mRNA 及蛋白相對表達量均比假手術組低，其中電刺激組高于對照組，提示功能性電刺激可以上調BDNF 及SYN 表達，增加神經元突觸連接，修復梗死損傷。研究表明[20-21]，BDNF 可以防止神經元受損，改善神經元病理損傷，在神經元的生長發育、存活、分化中起重要作用，SYN 參與突觸囊泡的形成與胞吐，在神經內分泌腫瘤中廣泛表達。在血管性癡呆大鼠模型中，功能性電刺激可以通過調節大鼠BDNF 及SYN 表達，誘發快速興奮性電位，提高神經元重塑功能，促進大腦結構恢復[22]。

綜上所述，功能性電刺激可能通過調控BDNF-SYN 軸，逆轉神經元損傷，改善受損腦部組織，為腦梗死的治療提供理論基礎和科學依據。