機械活性黏合劑敷料的制備及其性能

林裕衛,黃晁康,彭曉宏

(1.佛山金萬達科技股份有限公司,廣東 佛山 528000; 2.華南理工大學,廣東 廣州 510641)

傳統傷口敷料如干紗布、油紗布、繃帶、棉布等,起著保護傷口的基礎物理作用,而實際的創面情況是非常復雜的,包括細菌滋生、創口開裂等。傳統傷口敷料不能保持創面濕潤,在愈合期間,創面的新生組織與紗布粘連,更換敷料時容易觸動肉芽組織,導致患者不適。潮濕環境下肉芽組織的發育速度更快,濕傷口新形成的表皮細胞層的厚度和數量均大于干傷口[1],在創面保持濕潤狀態能夠促進傷口愈合,濕性敷料成為近幾年的重點研究方向。

水凝膠濕性敷料的親水特性能夠保持創面濕潤,形成濕傷口,在傷口細胞的增殖過程中,肌原纖維通過使傷口收縮促進傷口逐漸變小[2]。近幾年,功能化水凝膠敷料的大部分研究著重于藥物負載和釋放,過低的有效藥物濃度不能滿足加快傷口愈合的要求,過高的濃度存在一定細胞毒性,進一步破壞傷口組織,引起傷口發炎、壞死等情況。此外,水凝膠敷料通常無組織黏附性,直接使用容易掉落,不利于長時間將水凝膠固定在創口表面以達到持續治愈的效果。Li等[3]研究表明可以通過在水凝膠表面施加橋接聚合物的方式增加組織黏附性。

貽貝足絲分泌的黏蛋白能夠在潮濕環境下與大部分表面形成鍵合,具有強大的耐濕性黏合力[4],本文基于傷口收縮理論以及擬貽貝的結構,經兒茶酚基團偶聯法改性殼聚糖(CCS),并將其負載到功能化溫敏性水凝膠中,制備一種具有機械活性的水凝膠黏合劑敷料(HA),測試該敷料的性能,以用于藥物輸送系統、止血材料、組織工程材料和生物傳感器。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與設備

主要實驗儀器與設備如表1所示。

表1 主要實驗儀器與設備Tab.1 Main experimental instruments and equipment

1.2 實驗材料與試劑

主要實驗原料與試劑如表2所示。

表2 主要實驗原料與試劑Tab.2 Main raw materials and reagents for the experiment

2 仿生機械活性黏合劑敷料制備

2.1 殼聚糖-g-兒茶酚橋接聚合物(CCS)的制備

將殼聚糖(CS)溶解在50 mL質量分數為1%的乙酸溶液中,充氮氣鼓泡50 min以除去氧氣;將一定質量比的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和3,4-二羥基苯丙酸(HBC)[5]充分溶解在25 mL質量分數為50%的乙醇溶液中,將混合溶液加入至殼聚糖溶液中,在室溫下攪拌反應24 h。將上述溶液在透析膜中,用pH值為4.5的鹽酸溶液透析2 d,以除去未反應單體,用去離子水透析5 h;最后用冷凍干燥機在-40℃條件下將樣品溶液凍干24 h,得到最終產物水凝膠殼聚糖-g-兒茶酚(CCS)。CCS合成原料配方如表3所示。

表3 CCS合成的原料配方Tab.3 Formulations of CCS

2.2 HKUST-1功能化溫敏性水凝膠(PAGel-H)的制備

通過溶液法制備銅金屬有機框架(HKUST-1),將0.15 mmol醋酸銅一水合物和0.1 mmol 1,3,5-苯三甲酸分別溶于4 mL去離子水和無水乙醇中,然后將醋酸銅一水合物溶液逐滴滴加到1,3,5-苯三甲酸的乙醇溶液當中,均勻攪拌約30 min以獲得藍色懸浮液;以5 000 r/min轉速離心懸浮液8 min,分離獲得HKUST-1納米粒子;用體積分數為50%的乙醇溶液洗滌產物,重復洗滌3次以除去殘留的反應物,將收集的樣品在真空下干燥,密封保存在干燥器中。

利用自由基聚合反應與離子交聯反應制備聚(N-異丙基丙烯酰胺)/海藻酸鈣(Alg)溫敏性水凝膠(PAGel-H)。將一定量的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸十八酯(SA)、交聯劑甲基丙烯酰胺基苯乙酮和促引發劑N、 N,N′,N′-四甲基乙二胺添加于裝有10 mL去離子水的燒杯中,在室溫下將混合溶液攪拌均勻后,通入氮氣驅氧30 min;然后加入一定比例HKUST-1納米粒子,短時間攪拌后迅速將混合溶液倒入由2塊玻璃板和硅膠墊片制成的模具當中,反應24 h后將水凝膠樣品置于去離子水中浸泡48 h,定期換水以去除未反應的單體;最后將樣品用凍干機冷凍干燥,密封置于4℃冰箱保存備用,合成配方如表4所示。

表4 PAGel-H水凝膠合成配方Tab.4 Formulations of PAGel-H

2.3 仿生機械活性黏合劑敷料(HA)的制備

采用涂布法制備水凝膠黏合劑,在室溫下將CCS溶解在去離子水中,相比于未改性的CS,CCS的水溶性更佳[6],攪拌均勻制得橋接聚合物溶液;將CCS溶液均勻涂覆于PAGel-H的一側表面制得HA,應用時將涂有CCS的一面貼敷于傷口表面即可。

3 測試與表征

3.1 核磁共振氫譜(1H-NMR)測試

將CS和CCS溶于2%氘代乙酸溶液和氧化氘中,使用AVANCE III HD 400型核磁共振氫譜儀對其進行1H-NMR表征,以分析其組成。

3.2 紫外光譜(UV-Vis)測試

參照GB/T 26813—2011《雙光束紫外可見分光光度計》,使用紫外-可見分光光度計測定CCS上兒茶酚基團的接枝率,具體方法為:

①兒茶酚標準工作曲線的測定。準確稱量一定質量的3,4-二羥基苯丙酸(HBC),用去離子水定容至100 mL,然后稀釋配制成濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mmol/L的溶液,用紫外-可見分光光度計在波長范圍為200～800 nm內掃描,測定它們在λ=280 nm下的吸光度。

②CCS兒茶酚基團接枝率的測定。用去離子水溶解CCS制備質量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液,然后用紫外-可見分光光度計測定樣品溶液在波長280 nm處的吸光度,由標準工作曲線得出兒茶酚基團的濃度,每個樣品重復3次實驗,計算平均值。CCS兒茶酚基團的接枝率(GR)的計算公式[9]為:

(1)

式中:Mcat為兒茶酚基團的相對分子質量;Ccat為由標準曲線讀出的兒茶酚基團濃度,mmol/L;V為樣品溶液的體積,mL;WCCS為樣品溶液中CCS的質量,mg。

3.3 抗氧化性能測試

抗氧化性能參考文獻[7]中方法進行測試,并根據本文研究情況略加改動。

①ABTS自由基清除測試。準確稱量一定質量的2,2’-聯氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二氨鹽(ABTS)和過硫酸鉀(K2S2O8)溶于去離子水中,分別制得ABTS儲備液(7.4 mmol/L)和K2S2O8儲備液(2.6 mmol/L)。各取5 mL混合均勻,室溫下鋁箔包裹避光孵育16 h;調節混合溶液的濃度使其在波長734 nm處的紫外吸光度為(0.7±0.02),以獲得ABTS+工作液。分別取CCS溶液加入ABTS+工作液,在37℃下培養6 min,紫外-分光光度計測量在波長734 nm處的吸光度。每個樣品重復3次實驗。ABTS自由基清除率(Ca)的計算公式為:

(2)

式中:Aa0為對照組的吸光度,L/(g·cm);Aai為不同樣品溶液的吸光度,L/(g·cm)。

②超氧自由基清除測試。分別取不同質量的CCS樣品加入到12 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L、pH值8.1)中,搖勻溶液至充分溶解后加入2 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L),然后將混合物放置于37℃恒溫恒濕培養箱,避光培養5 min;最后加入0.5 mL 鹽酸溶液(8 mmol/L)終止反應,紫外-分光光度計測量在波長320 nm處的吸光度。每個樣品重復3次實驗,取平均值。超氧自由基清除率(Cc)的計算公式為:

(3)

式中:Ac0為對照組的吸光度;Aci為不同樣品溶液的吸光度。

3.4 組織黏附性能測試

采用搭接剪切法對水凝膠黏合劑的組織黏附性進行表征。將從市場購買的新鮮豬皮剪成長75 mm、寬25 mm的樣條;將水凝膠黏合劑黏附在2塊豬皮中間,其中重疊搭接區域大小為25 mm×25 mm。使用電子萬能材料試驗機對樣品進行單軸拉伸測試,拉伸速率為5 mm/min,結束條件為水凝膠破裂或從豬皮上剝離。每個樣品重復5次實驗,計算平均值作為結果。黏合強度(AS)定義為拉伸過程中最大拉伸力與搭接區域面積之比,其計算公式為:

(4)

式中:Fm為最大拉伸力,N;A為搭接區域面積,m2。

3.5 體外抗菌性能測試

通過平板菌落計數法表征水凝膠的抗菌活性。預先制備圓柱狀水凝膠樣品,并放置在紫外光照射下正反面滅菌0.5 h,置于6孔細菌培養板備用,每孔加入1 mL PBS緩沖液,使用酶標儀測量波長在 600 nm處的吸光度(OD值),隨后加入PBS緩沖液將菌液按濃度梯度稀釋至1×106CFU/mL。將6孔板放入37 ℃的二氧化碳恒溫培養箱內培養24 h。將6孔板置于超聲波清洗器中超聲波處理1 min,移取混合溶液并依次以10倍梯度稀釋,待培養基吸收菌液后倒置放于37 ℃的二氧化碳恒溫培養箱內培養18 h,計算瓊脂培養基上的菌落數,每個樣品重復3次實驗。細菌存活率(BV)的計算公式為:

(5)

式中:ABV0為對照組菌落數,CFU;ABVi為水凝膠實驗組菌落數,CFU。

3.6 體外傷口閉合測試

在新鮮外植的大鼠皮膚上進行體外傷口閉合測試。使用穿孔器(直徑10 mm),記錄原始傷口大小,然后把黏合劑樣品裁剪,將其按壓至傷口并冷敷10 min,將皮膚于37℃下培養24 h;拍攝傷口,用Imagine J測量傷口大小。體外傷口閉合率(EWC)的計算公式為:

(6)

式中:S為傷口的原始面積,mm2;St為處理后的傷口面積,mm2。

3.7 體內創面愈合測試

對8～10周齡的SPF級大鼠用質量分數5%的水合氯醛麻醉,在無菌條件下用直徑為10 mm的穿孔器勒出傷口,每1組大鼠為5只,第1組大鼠傷口用PBS緩沖液(40 μL)處理作為空白對照;其余3組分別將聚丙烯酰胺/海藻酸銅水凝膠黏合劑(PAAm-Alg+CCS)、機械活性水凝膠黏合劑(PAGel+CCS)和抗菌機械活性水凝膠黏合劑(HA)貼敷于傷口表面,其中PAGel+CCS和HA需先冷敷5 min。通過Imagine J測量傷口大小,表征水凝膠黏合劑促進大鼠傷口愈合的作用,通過式(7)計算體內傷口愈合率(IWC):

(7)

式中:S0為第0天的傷口面積,mm2;Sn為第n天的傷口面積(n=1、3、5、8、11、14),mm2。

3.8 體外細胞毒性測試

使用CCK-8法評估藻酸鈣-聚(N-異丙基丙烯酰胺)雜化網絡水凝膠(PAGel)、PAGel-H和CCS的細胞毒性。將滅菌后的水凝膠樣品浸泡在去離子水中(5 mg/mL),并在37 ℃下孵育24 h以收集浸出液;此外,將CCS溶解在去離子水中,以收集溶液。培養小鼠成纖維細胞(L929),并進行細胞計數;調整含量為3×103個/mL,取100 μL細胞液接種在96孔細胞培養板中,并放入二氧化碳培養箱預培養24 h,然后向細胞液中加入含有樣品浸出液的DMEM培養基,在37℃下放入二氧化碳培養箱培養,對照組用PBS代替樣品浸出液進行細胞培養。分別在第1、4和7 d取出96孔板,加入10 μL CCK-8試劑培養4 h,然后使用酶標儀測量細胞懸液在λ=450 nm處的吸光度(OD)。通過Calcein-AM/PI雙染細胞法進行細胞活/死染色測試,取一定量與細胞懸液共培養第1和4 d的樣品液進行染色,然后使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞活/死情況,拍照記錄。

4 結果與討論

4.1 1H-NMR分析

HBC、CS和CCS的1H-NMR結果如圖1所示。

圖1 HBC、CS和CCS的1H-NMR圖Fig.1 1H-NMR spectra of HBC, CS and CCS

HBC在δ=6.72、6.64、6.51處出現3個吸收峰,分別歸屬于苯環上的3個質子,在δ=2.66和δ=2.45顯示了位置a和b 2個亞甲基上質子的吸收峰;CS分子鏈上位置f的質子峰在δ=3.06處出現,而在位置g～j上的質子峰分別對應δ=3.61～3.80范圍內的吸收峰,乙酰化甲基的峰出現在δ=1.95處。相比之下,CCS中均出現上述質子峰,表明兒茶酚基團成功接枝到CS上。

4.2 UV-Vis分析

通過UV-Vis測試分析CCS的組成,對兒茶酚基團的接枝率進行計算。如圖2(a)所示,不同濃度的HBC溶液在λ=280 nm處出現屬于苯環的吸收峰。測定不同濃度HBC溶液在λ=280 nm處的吸光度,吸光度與HBC濃度工作曲線如圖2(b)所示。測定同一濃度下不同制備參數的CCS的吸光度,計算CCS上兒茶酚基團的接枝率。CCS中兒茶酚基團的接枝率如表5所示。隨著HBC用量從0.15%增加到0.75%,CS能夠與更多的HBC進行反應,接枝率從5.90%上升至11.53%。

圖2 CS和不同濃度的HBC的反應分析Fig.2 Reaction analysis of CS and different concentrations of HBC.(a)UV-visible absorption spectra;(b)Standard operating curve of HBC

表5 CCS中兒茶酚基團的接枝率Tab.5 Grafting rate of catechin group in CCS

4.3 抗氧化性能分析

不同接枝率與CCS質量濃度對ABTS自由基的清除率如圖3所示。ABTS自由基清除經過氧化鉀氧化后形成離子自由基ABTS+,加入CCS后會與ABTS+發生反應使其還原成ABTS。在同一質量濃度下對比CS與CCS-1～CCS-5的自由基清除率可知,CCS具有較好的清除能力(均大于CS),由此可知兒茶酚基團具有一定的抗氧化作用;在50 μg/mL的質量濃度下,不同接枝率的CCS-1～CCS-5樣品的清除率分別為63.82%、72.57%、88.30%、98.00%和98.29%,由此可以說明增加兒茶酚基團能夠有效提高自由基清除率。

不同接枝率與CCS質量濃度對超氧自由基的清除率如圖4所示。鄰苯三酚法測試CCS的超氧自由基清除能力的原理是鄰苯三酚在堿性溶液中發生氧化反應,生成超氧陰離子。CCS的超氧自由基清除能力與兒茶酚基團的濃度成正相關,通過提高兒茶酚基團的接枝率和CCS質量濃度的方法可以增強超氧自由基的清除能力,在測試范圍內可達97.50%(CCS-5、5 mg/mL)。

4.4 組織黏附性能分析

根據水凝膠耗能黏合機制[8],高黏附性需要在強韌性水凝膠和黏附性橋接層的協同作用下實現。水凝膠黏合劑的皮膚組織黏附示意圖如圖5所示。

CCS作為橋接聚合物涂覆于水凝膠的表面,可提高水凝膠的黏附性能,兒茶酚基團與皮膚組織上的氨基、巰基等活潑基團逐漸發生不可逆的共價反應,增強長期黏附力[9-10]。

不同HKUST-1質量分數的PAGel-H樣品的黏附力-位移曲線和黏合強度如圖6所示。當HKUST-1用量為0.05%時,黏附強度下降了0.39 kPa,而后隨著PAGel-H中HKUST-1用量增加,PAGel-H1～PAGel-H5的黏合強度分別為1.66、2.82、3.98、4.05和5.46 kPa,與水凝膠的拉伸強度成正相關。這是因為當水凝膠的力學性能更優時,在拉伸過程中表現為斷裂時所需的載荷更高。

圖6 不同PAGel-H樣品的組織黏附性能測試結果Fig.6 Test results of tissue adhesion performance of different PAGel-H samples.(a)Adhesion displacement curve; (b)Adhesion strength diagram

不同黏合界面的HA的黏附力-位移曲線和黏合強度如圖7所示。無界面溶液、PBS緩沖液和HBC溶液(質量分數2%)界面的HA黏合強度較低,僅為1.60、1.19和1.39 kPa;界面的HA有所提升,黏合強度為2.29 kPa;CCS界面的HA最高,達到5.46 kPa。當界面中存在CS或CCS時,CS通過靜電吸引作用附著在皮膚表面,同時兒茶酚基團可發生氧化反應繼而形成共價連接,證明CCS作為橋接聚合物溶液能夠有效提高水凝膠黏合劑的黏合強度。

不同兒茶酚接枝率的HA的黏附力-位移曲線和黏合強度如圖8所示。隨著接枝率升高,黏合強度呈上升趨勢,當接枝率為5.90%(CCS-1)時,其黏合強度僅為2.62 kPa,而接枝率提升至11.53%(CCS-5)時,黏合強度提高至5.46 kPa。這歸因于同一CCS濃度下,增加兒茶酚基團數能夠使HA與皮膚組織產生更多黏附反應位點,橋接聚合物可以將水凝膠牢牢地固定在皮膚上。

圖8 不同兒茶酚接枝率的HA的黏附性能測試結果Fig.8 Adhesion performance test results of HA with different catechol grafting rates.(a) Adhesion displacement curve;(b) Adhesion strength graph

不同質量分數CCS的HA的黏附力-位移曲線和黏合強度如圖9所示。橋接聚合物CCS質量分數對黏合強度存在一定影響。在本文實驗用量范圍內,隨著CCS質量分數增加,黏合強度先增強后減弱,當質量分數從0.50%提高至1.25%,黏合強度從2.48 kPa升至5.46 kPa;然而CCS質量分數到達1.50%時,黏合強度降低了1.65 kPa。這是因為當CCS質量分數較低時,橋接聚合物溶液的黏合強度較低。黏合強度隨著CCS質量分數增加而驟增,超過一定閾值后其溶液流動性較差,反而作為一種潤滑劑使水凝膠在皮膚上滑移。

圖9 不同質量分數CCS的HA的黏附性能測試結果Fig.9 Adhesion performance test results of HA with different CCS concentrations.(a) Adhesion displacement curves; (b) Adhesion strength plots

不同黏合時間的HA的黏附力-位移曲線和黏合強度如圖10所示。由黏合機制可知兒茶酚基團會發生氧化并與皮膚組織上的氨基反應,因此根據黏合時間(氧化程度)的不同,黏合強度發生變化。隨著黏合時間增長,黏合強度明顯得到提升,可從5.46 kPa(0.5 h)提高至15.49 kPa(8 h)。

圖10 不同黏合時間的HA的黏附性能測試Fig.10 Adhesion performance test of HA with different adhesion times. (a) Adhesion displacement curve; (b)Adhesion strength graph

4.5 體外抗菌性能分析

不同水凝膠樣品的菌落涂布圖、大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的細菌存活率如圖11所示。根據公式計算得出在HKUST-1質量分數為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%時,對于大腸桿菌的細菌存活率分別為20.6%、8.9%、7.8%、2.0%和1.3%,對于金黃色葡萄球菌的細菌存活率分別為25.8%、15.7%、12.5%、2.5%和1.9%。

圖11 不同水凝膠樣品的抗菌性能分析Fig.11 Analysis of antibacterial properties of different hydrogel samples. (a)Colony coating diagram of different hydrogel samples; (b)E. coli bacterial survival rate;(c) S. aureus bacterial survival rate

水凝膠的抗菌性能與細菌的接觸方式和銅離子的釋放行為有關,將接種細菌后的水凝膠放置于37℃下,一部分細菌與水凝膠直接接觸并且被固定的銅離子殺死;另一部分會與隨著水分子而被擠出水凝膠外的游離的銅離子相互作用,繼而被滅活。當增加HKUST-1用量時,更多的銅離子與細菌發生生理學反應,細菌存活率逐漸下降。HA對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率分別為1.7%和1.6%,這與PAGel-H5水凝膠的實驗結果基本一致。

4.6 體外皮膚組織收縮性能分析

本文模仿創口處肌原纖維促使皮膚收縮從而加快傷口愈合的生物策略,制備具有機械活性的水凝膠黏合劑HA。該水凝膠黏合劑一方面作為物理屏障,能夠構建一個適合傷口恢復的濕潤微環境;另一方面可以施加足以促進主動傷口閉合的收縮力,使創面周圍的皮膚組織收縮,發揮加快傷口愈合的作用。HA的體外皮膚組織收縮示意如圖12所示。

圖12 HA的體外皮膚組織收縮示意圖Fig.12 Schematic diagram of skin tissue contraction of HA in vitro

不同水凝膠黏合劑處理后的皮膚組織和體外傷口閉合率如圖13所示。HA與PAAm-Alg+CCS對體外傷口閉合存在顯著差異,HA處理后傷口面積從9.86 mm2減小至5.03 mm2,這是因為在HA的溫敏自收縮性和組織黏附雙重作用下,拉動失活的皮膚緊縮,宏觀上表現為創口面積縮減,這為HA作為機械活性水凝膠敷料提供了可能性。

4.7 體內創面愈合分析

為了表征水凝膠黏合劑對于傷口愈合的影響,本文采用大鼠背部缺損模型進行動物實驗,減弱大鼠傷口周圍皮膚因愈合而主動收縮的影響,實驗結果如圖14所示。

注:“*”代表實驗組與PBS對照組存在顯著性差異,P<0.05。圖14 水凝膠黏合劑對于傷口愈合的影響圖Fig.14 Influence of hydrogel adhesive on wound healing.(a)Photographs of rat wound treated with different adhesives on 0d, 1d,3d, 5d, 8d, 11d and 14d; (b) Internal wound closure; (c)Photographs of rat wound in the initial coverage phase

由圖14(a)(b)可知,實驗中大鼠傷口大小均隨著時間逐漸縮小,手術后第1 d,所有傷口均出現炎癥;除PBS緩沖液處理的傷口外,其余3組經水凝膠黏合劑貼敷的傷口都保持濕潤。在第3 d,經PAAm-Alg+CCS、PAGel+CCS和HA處理后的創面愈合率分別為21.36%、25.28%和30.82%,均大于PBS緩沖液處理的傷口(7.93%),表明通過在水凝膠黏合劑中引入銅離子和溫度響應網絡的2種方法都有利于修復損傷創面。

銅離子的釋放降低創面傷口被細菌感染的風險,誘導血管生成,促進血管內皮細胞分泌生長因子(VEGF)[10];具有機械活性的水凝膠黏合劑能夠施加一個主動收縮傷口附近皮膚的機械力加快愈合的能力。

此外,可在覆蓋初期階段評價水凝膠的機械活性(圖14(c))。在冷敷結束后0.5 h,水凝膠黏合劑逐漸變白,結合上述創面愈合率的分析,共同說明了具有機械活性的水凝膠黏合劑在貼合過程中,能夠感應溫度而發生相轉變行為,證明HA水凝膠黏合劑能夠通過主動收縮皮膚的方式促進傷口愈合。

不同黏合劑處理后第3、8和14 d組織染色照片如圖15所示。在手術后第3 d,所有染色組織中均觀察到不同程度的中性粒細胞浸潤現象,此時傷口處于炎癥期。經PBS處理的傷口中可以觀察到80%以上數量的中性粒細胞,表明傷口發炎嚴重,而經PAAm-Alg+CCS和HA處理后的傷口中性粒細胞數量不到20%,這歸因于水凝膠的HKUST-1的抗菌效果。在第8 d,可以看到實驗組的創面出現少量成纖維細胞和膠原纖維,其中經HA處理的傷口顯示出相對均勻和密集的膠原纖維,這說明HA可以促進肉芽組織的形成和傷口的再上皮化。在手術后14 d,所有創面均愈合良好。上述結論進一步證實了HA可作為傷口敷料促進傷口愈合。

圖15 不同黏合劑處理第3、8和14 d組織染色照片Fig.15 Photographs of HA staining tissue treated with different adhesives on 3 d, 8 d and 14 d

4.8 細胞相容性分析

由CCK-8法測定樣品浸提液與L929細胞共同培養第1、4和7 d的OD值,其結果如圖16(a)所示,所有樣品在4和7 d的OD值均出現明顯上升,這說明樣品并未對L929細胞的增殖行為造成顯著影響,其細胞毒性較低。此外,在激光共聚焦顯微鏡觀察下的細胞活/死染色情況(如圖16(b)所示),其中綠色斑點為活細胞,紅色斑點為死細胞。不同樣品與L929細胞共同培養96 h后活細胞明顯增多,L929細胞能夠在樣品的影響下維持正常的生理活動,這同樣說明樣品的細胞毒性較低,與CCK-8實驗結果一致。綜上所述,生物相容性良好的PAGel-H水凝膠和CCS能夠為應用于創口醫用敷料的水凝膠黏合劑提供低毒性的愈合環境。

注:“*”代表實驗組與對照組存在顯著性差異,P<0.05。圖16 生物相容性分析圖Fig.16 Biocompatibility analysis diagram.(a)OD values of L929 cells cultured with PAGel, PAGel H, and CCS on 1d, 4 d and 7 d;(b)Cell viability/mortality staining photos on 1 d and 4 d of culture

5 結 論

本文通過偶聯法制備殼聚糖-g-兒茶酚(CCS),并且以聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)和海藻酸鈣(Alg)為主要網絡的HKUST-1負載的抗菌活性溫敏性交聯互穿水凝膠(PAGel-H)為基體,通過涂布法制備水凝膠黏合劑(HA),測試和表征結果表明:

①1H-NMR譜圖中顯示了官能團的特征質子峰,證明CCS已經成功合成;根據UV-Vis譜圖中吸光度的差異,計算出HBC質量分數分別為0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%時,兒茶酚基團在CCS結構上的接枝率分別為5.90%、6.44%、8.37%、10.4%、11.53%;CCS的抗氧化能力均隨著CCS濃度和兒茶酚基團接枝率的提高而增強。

②CCS作為橋接聚合物溶液可有效提升水凝膠皮膚黏合強度,同時分別提高水凝膠基體的強度、兒茶酚接枝率和黏合時間可對皮膚黏附性能起促進作用。

③PAGel-H具有明顯的抗菌效果,當HKUST-1負載量增加時,抑菌圈直徑逐漸擴大,細菌存活率逐漸下降;在37℃下HA水凝膠黏合劑能夠發生自收縮現象,同時可以施加致使皮膚收緊的收縮力,在大鼠背部缺損模型中,經水凝膠黏合劑處理后的創面所需愈合天數最少(11 d),愈合速率最快;PAGel、PAGel-H和CCS的吸光度(OD)值均隨著時間而上升,說明負載HKUST-1的PAGel-H和CCS的細胞毒性較弱。