熔融尿素法提取廢棄羊毛角蛋白的機制

薩如拉,曹 蝶,張志潔,楊曉雪,邢佳佳,劉 爽,宋媛媛

(赤峰學院 化學與生命科學學院,內蒙古 赤峰 024000)

羊毛作為一種天然蛋白質資源,其角蛋白含量高達95%,被認為是一種有巨大潛在價值的蛋白質資源[1-2]。山羊毛經提絨后殘留大量的廢棄粗長毛,回收利用率低,我國每年平均生產9 萬t左右的粗長毛及廢棄羊毛織物,它們的質量低下、加工難度大、不易降解,絕大部分都被廢棄、填埋、焚燒而很難得到充分利用,不僅污染環境,而且浪費了大量的動物性蛋白資源[3-5]。開發新型羊毛角蛋白提取技術是實現廢棄羊毛高效利用、經濟、環保的途徑[6-7]。羊毛主要成分為角蛋白[8],角蛋白由胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等18種氨基酸組成[9],具有親膚性、生物相容性、對人體無毒無刺激性等多種優良特性,有較高的再生價值[10]。角蛋白的提取是廢棄羊毛有效利用的至關重要的步驟,目前羊毛角蛋白的提取方法主要有氧化法、酸堿法、還原法、金屬鹽法、酶法、離子液體法、低共熔體系法、熔融尿素法[11-13]等。熔融尿素法采用價格低廉的尿素為原料,在尿素熔點(132.7 ℃)以上溫度進行溶解羊毛試驗。溶融尿素法用料單一,需要時間短,尿素和羊毛角蛋白的分離過程簡便,羊毛溶解率較高,熔融后產生的尿素廢液可以作為農業肥料回收利用[7-8]。利用熔融尿素法提取羊毛角蛋白綠色環保,具有實用價值,適合未來發展趨勢。

根據Tanahashi等[14]、Murate 等[15]的研究,尿素溶解羊毛可能是熔融尿素在高溫下分解產生氨氣,進入角蛋白結晶區,破壞角蛋白之間的氫鍵所致。本文以羊毛為原料,采用熔融尿素法提取羊毛角蛋白,研究羊毛/尿素質量比、提取溫度、提取時間對羊毛溶解率和羊毛角蛋白提取率的影響。同時,為了研究羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解機制,以白蛋白模擬羊毛角蛋白的化學鍵及結構,推測了羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解機制,為后續廢棄羊毛的高效利用以及動物性纖維的再利用提供理論依據和技術支撐。

1 試驗部分

1.1 試驗材料及儀器設備

材料:羊毛(產于內蒙古克什克騰旗),色氨酸、苯丙氨酸、尿素、乙酸乙酯、硫酸鈉、丙酮均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司),白蛋白(分子量40 000,北京亞米生物科技有限公司),纖維素透析袋(分子量8 000～10 000,上海源葉生物科技有限公司)。

儀器:HH-SA型高溫油浴鍋(金壇市順華儀器有限公司)、CS101-AB烘干箱(重慶試驗設備廠)、FA-1004型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)、BR4I型離心機(Thermo公司)、RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)、GCMS-TQ8040型氣相色譜質譜聯用儀(日本島津公司)、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊毛預處理

羊毛先用洗潔精清洗干凈,再用蒸餾水清洗至無洗潔精殘留,曬干,備用。

1.2.2 熔融尿素法提取羊毛角蛋白

稱取一定量的尿素倒入燒杯中,把燒杯放入加熱至一定溫度的油浴鍋中恒溫加熱,尿素完全熔融后放入一定量的羊毛溶解一定時間,從油浴鍋中取出燒杯,為了防止尿素凝固,在燒杯中加入100 mL蒸餾水,過濾,烘干被截留物,作為不溶物。濾液裝入纖維素透析袋中靜止透析48 h(每12 h換一次蒸餾水),最后烘干透析袋中的溶液,得到主要成分為角蛋白的羊毛角蛋白[7-8]。羊毛的溶解率按式(1)計算,羊毛角蛋白的提取率按式(2)計算。

(1)

(2)

式中:D1為不溶物質量,g;D0為羊毛質量,g;D2為羊毛角蛋白質量,g。

1.2.3 白蛋白分子量的測定

準確稱量4份6.25 g尿素倒入燒杯中,把燒杯放入160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,在熔融尿素中各加入0.5 g白蛋白,分別反應10、20、40、80 min后取出燒杯,燒杯中加入100 mL 蒸餾水后倒入纖維素透析袋中進行靜止透析 48 h(每12 h換一次蒸餾水),過濾透析袋中的溶液,沉淀為非水溶性蛋白,濾液為水溶性蛋白。以白蛋白為參照物,將水溶性蛋白為原料,以15% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定其分子量[16-17]。

1.2.4 白蛋白與熔融尿素的反應

準確稱量6.25 g尿素倒入燒杯中,把燒杯放入 160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,在熔融尿素中加入0.5 g 白蛋白,反應20 min 后取出燒杯,燒杯中加100 mL蒸餾水后倒入纖維素透析袋中進行靜止透析,透析3 h后取透析外液150 mL,使用150 mL乙酸乙酯分液3次,取有機層,硫酸鈉脫水有機層,濃縮干燥。稱取濃縮物1 mg于10 mL離心管中,加入1 mL丙酮溶解,使用氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)進行分析。

使用設備及測定條件: GC-MS-QP5050A;毛細管柱: DB-5MS(J&W Scientific)、0.25 mm (I.D.)× 30 m ( L) × 0.5 μm;載氣He;電離方式EI;電離電壓 70 eV。成分分析條件為:進樣溫度230 ℃;氣化室溫度300 ℃;升溫程序:初始溫度100 ℃保持5 min,以10 ℃/min 速率升至300 ℃,保持5 min;分析時間 5～30 min。

1.2.5 氨基酸與熔融尿素的反應

準確稱量2份6.25 g 尿素倒入燒杯中,把燒杯放入160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,熔融尿素中分別加入色氨酸和苯丙氨酸各0.5 g,反應20 min后取出燒杯,燒杯中加50 mL 蒸餾水,再加100 mL乙酸乙酯分液3次,取有機層,硫酸鈉脫水有機層,濃縮干燥。稱取濃縮物1 mg于10 mL離心管中,加入1 mL丙酮溶解,進行氣相色譜質譜(GC-MS)分析。使用設備及測定條件為同1.2.4節。

2 結果與分析

2.1 羊毛與尿素質量比對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節試驗方法,稱取5份1 g羊毛,分別放入7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g、160 ℃的熔融尿素中,反應20 min提取羊毛角蛋白,測試并計算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

羊毛/尿素質量比對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖1所示。隨著尿素質量比例的增加,羊毛溶解率和角蛋白提取率也增加,當m(羊毛)∶m(尿素)達到1∶12.5時,溶解率和提取率都達到了最高值。m(羊毛)∶m(尿素)小于1∶12.5時,熔融尿素量較小,不能完全浸沒羊毛,雖然有攪拌,但有些羊毛仍然未能與熔融尿素充分接觸,導致溶解率和提取率較低。m(羊毛)∶m(尿素)增加至1∶12.5以上時,熔融尿素與羊毛能夠充分接觸,提高了羊毛溶解率和角蛋白提取率。m(羊毛)∶m(尿素)再增加時溶解率和提取率的提高幅度較小,基本不再提升,說明羊毛溶解率和角蛋白提取率都達到了最高值。因此,最佳羊毛與尿素質量比為1∶12.5。本文試驗中提取率比溶解率低的可能原因為在160 ℃、20 min條件下,被溶解的羊毛蛋白質(高分子)的一部分被降解成較小分子的蛋白質或多肽,甚至有可能降解成氨基酸,部分分子量小于8 000的蛋白質、多肽、氨基酸透過透析袋進入了透析外液中被棄掉,因此提取率低于溶解率。

圖1 羊毛與尿素質量比對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of wool/urea mass ratio on wool dissolution rate and keratin extraction rate

2.2 反應溫度對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節試驗方法,稱取5份1 g羊毛,分別放入140、150、160、170、180 ℃的12.5 g熔融尿素中,反應20 min提取羊毛角蛋白,測試并計算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反應溫度對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖2所示。雖然160 ℃時羊毛溶解率最高,但各加熱溫度條件下羊毛溶解率變化幅度較小。反應溫度140 ℃、反應時間20 min以上時,能夠溶于熔融尿素的羊毛角蛋白全部溶解。隨著反應溫度的上升角蛋白提取率逐漸下降,可能原因為反應溫度較低時羊毛角蛋白的化學鍵不易斷裂、角蛋白降解程度較低、角蛋白分子量較大,不易透過透析袋,較多的角蛋白留在透析袋中,因此角蛋白的提取率較高。但是隨著反應溫度的上升,角蛋白的有些化學鍵被斷裂,高分子量角蛋白可能降解成低分子量的角蛋白、短肽、游離氨基酸等,容易透過透析袋,使提取率降低。

圖2 反應溫度對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

2.3 反應時間對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節試驗方法,稱取5份1 g羊毛,放入160 ℃、12.5 g熔融尿素中,分別反應10、15、20、25、30 min提取羊毛角蛋白,測試并計算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反應時間對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖3所示。隨著反應時間的延長溶解率的變化幅度較小,反應時間20 min時溶解率最高,延長反應時間溶解率幾乎不變,說明羊毛中能夠溶于熔融尿素的成分已經全部溶解,因此最佳反應時間為20 min。隨著反應時間的延長角蛋白提取率逐下降,在10 ～15 min之間的提取率下降的幅度較小為1.58%,但15～20 min之間的提取率下降的幅度較大為18.26%。在160 ℃高溫熔融尿素中,羊毛角蛋白的一些化學鍵在反應時間小于15 min時不會斷裂,超過15 min時逐漸斷裂,部分高分子角蛋白降解成小分子蛋白、多肽、氨基酸等,這些小分子很容易透過透析袋,使羊毛角蛋白的提取率下降,并且反應時間越長角蛋白的降解程度越大,提取率越低。

圖3 反應時間對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of reaction time on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

綜上所述,使用熔融尿素法提取羊毛角蛋白時羊毛與尿素質量比1∶12.5、反應溫度160 ℃、反應時間20 min時,羊毛角蛋白全部溶解于熔融尿素中,但隨著反應溫度、反應時間的增加羊毛角蛋白的提取率降低。

2.4 溶解白蛋白的分子量測定

由于羊毛角蛋白的分子量未知[16],確認分子量降低程度的試樣不充分,因此,以已知分子量的白蛋白為原料,以便于推測羊毛與熔融尿素反應后角蛋白分子量變化的規律。白蛋白與熔融尿素反應后分子量的測定結果如圖4所示。參照白蛋白在分子量40 000 Da的位置出現了電泳帶,反應時間10、20 min時,白蛋白分子量出現了片斷性電泳帶,分子量21 000～40 000 Da之間的位置有較濃的電泳帶,分子量14 000 Da以下的位置有2條較淡的電泳帶,可見10、20 min時大部分蛋白質仍然保持較高的分子量,但部分蛋白質已經降解成分子量小于14 000 Da的蛋白質或氨基酸。反應時間40、80 min時的白蛋白分子量在14 000 Da以下的位置出現了較濃的電泳帶,可見大部分蛋白質降解成分子量小于14 000 Da的蛋白質或氨基酸。以上結果表明,白蛋白與尿素的反應時間越長,更多的白蛋白降解成低分子量蛋白質或多肽,甚至有可能降解成氨基酸。因此可以推測,雖然羊毛角蛋白的分子量較大、結構較復雜,但適宜的反應條件下熔融尿素使羊毛角蛋白降解、分子量降低。

圖4 白蛋白分子量的測定Fig.4 Determination of albumin molecular mass

2.5 白蛋白、氨基酸與熔融尿素的反應

白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應物的GC測定結果與色譜峰對應的化合物如圖5所示。色氨酸與白蛋白反應透析外液都在保留時間26 min出現了色譜峰,通過MS進一步分析確定了二者26 min色譜峰的化合物為同一種化合物,即色氨酸與尿素反應產物。白蛋白與熔融尿素透析外液在保留時間26 min時化合物的峰值最大,可以確定在白蛋白降解過程中產生最多的氨基酸為色氨酸。苯丙氨酸與白蛋白反應透析外液都在保留時間19 min出現了色譜峰,通過MS進一步分析確定了二者19 min色譜峰的化合物為同一種化合物,即苯丙氨酸與尿素反應產物。通過以上試驗結果可以看出,熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸,以此類推熔融尿素也可以使羊毛角蛋白降解成氨基酸。依據GC-MS檢測結果推測的氨基酸、蛋白質與熔融尿素的反應機制如圖6所示。

圖5 色氨酸、白蛋白、苯丙氨酸與熔融尿素反應物GC測定結果與色譜峰對應的化合物Fig.5 Compounds corresponding to chromatographic peaks in the gc determination results of albumin, tryptophan, phenylalanine and molten urea reactants. (a)Albumin reacts with molten urea;(b)Tryptophan reacts with molten urea in dialysis fluid;(c)Phenylalanine reacts with molten urea

圖6 氨基酸、蛋白質與熔融尿素反應機制Fig.6 Reaction mechanism of amino acid, protein and molten urea

色氨酸、苯丙氨酸和熔融尿素的第1階段反應從氨基酸的氨基開始,與尿素的羰基進行親核反應,形成氨基酸尿素中間體;第2階段反應為分子內部反應,原尿素的氨基與原氨基酸的羰基進行親核反應而形成環狀結構(乙內酰脲環),最終色氨酸、苯丙氨酸與尿素結合形成乙內酰脲環。在氨基酸與尿素反應機制的基礎上,推測了蛋白質與尿素的反應機制,第1階段反應為蛋白質N末端氨基酸的氨基與尿素的羰基進行親核反應,形成蛋白質尿素中間體;第2階段反應也是分子內部反應,原尿素的氨基與原氨基酸的羰基進行親核反應,肽鍵斷裂,N末端的氨基酸形成乙內酰脲環,蛋白質降解1分子氨基酸,蛋白質本身變成比原來少1個氨基酸的蛋白質。

3 結 論

為了高效提取羊毛角蛋白及探究羊毛角蛋白溶于熔融尿素的溶解機制,采用熔融尿素法優化了提取工藝、測定了與熔融尿素作用降解后白蛋白的分子量、分析了白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應的溶解液,得到了以下結論:

①熔融尿素法溶解羊毛的最佳工藝條件:羊毛與尿素質量比1∶12.5、反應溫度160 ℃、反應時間20 min,羊毛溶解率為86.32%。隨反應溫度的上升及反應時間的增加羊毛角蛋白的提取率均降低。

②白蛋白與熔融尿素反應后白蛋白分子量降低,反應時間越長分子量降低幅度越大。

③對比分析白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應溶解液發現,白蛋白透析外液中存在色氨酸與苯丙氨酸,證明了熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸。

④推測羊毛角蛋白與熔融尿素反應的機制為熔融尿素使角蛋白的N端肽鍵斷裂,從角蛋白的N端開始釋放氨基酸,最終角蛋白可以降解成較低分子蛋白質、肽、氨基酸。