清宣醒鼻法對兒童變應性鼻炎轉錄組學的影響

艾 斯，余巖雁，江寶春，鄭 健

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一，也是具有挑戰(zhàn)性的難治性疾病，其發(fā)病率居高不下［1］。AR 治療的關鍵在于避免接觸過敏原及藥物治療（包括糖皮質激素、抗組胺藥、白三烯受體拮抗劑、肥大細胞膜穩(wěn)定劑、減充血劑、抗膽堿藥等），但臨床療效尚不理想，并發(fā)癥較多，因此研究安全、高效的AR 治療藥物具有重要意義。AR 屬中醫(yī)學“鼻鼽”范疇，急性發(fā)作期以肺經伏熱為病機關鍵，因此，本課題組提出清宣醒鼻法是發(fā)作期的核心治法［2］，醒鼻宣竅湯內服配合醒鼻凝膠滴鼻劑滴鼻是清宣醒鼻法的具體體現(xiàn)。轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）是用高通量基因測序技術測定特定標本的幾乎全部轉錄本序列，可從基因水平對AR 的發(fā)病機制進行更精確的探究，對AR治療關鍵靶點的挖掘具有重要意義［3］。本課題研究利用RNA-seq 技術探討AR 患兒轉錄調控的基因表達特征，進一步明確清宣醒鼻法治療AR 的藥物作用靶點，為清宣醒鼻法治療AR 的臨床應用提供理論依據，豐富中醫(yī)藥治療AR 的理論基礎。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準 AR 診斷標準參照《變應性鼻炎診斷和治療指南（2015 年，天津）》［1］。① 癥狀：打噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞等癥狀出現(xiàn)2 個或以上，每天癥狀持續(xù)或累計在1 h 以上，可伴有眼癢、流淚和眼紅等眼部癥狀；② 體征：常見鼻黏膜蒼白、水腫，鼻腔水樣分泌物；③ 變應原檢測：至少1 種變應原皮膚點刺試驗和/或血清特異性IgE陽性。

1.1.2 中醫(yī)辨證要點 參照《中醫(yī)兒科臨床診療指南·小兒鼻鼽》［4］中肺經伏熱證辨證要點。

1.1.3 納入標準 ① 符合診斷及辨證標準；② 年齡3～14 歲；③ 處于AR 急性發(fā)作期；④ 患者及家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書。

1.1.4 排除標準 ① 合并有其他變態(tài)反應性疾病，需要長期堅持服藥而不能停藥者；② 已接受其他相關疾病的治療，可能影響本研究效應指標觀測者；③ 合并有支氣管哮喘急性發(fā)作、呼吸道感染、慢性鼻-鼻竇炎、上氣道咳嗽綜合征、分泌性中耳炎、鼻息肉、鼻部腫瘤等疾病者；④ 合并有心、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重危及生命的原發(fā)性疾病以及精神病患兒；⑤ 依從性差，不配合診療及隨訪者。

1.2 一般資料 選取2020 年7 月—2021 年7 月于福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院門診就診的肺經伏熱型AR患兒20例，其中男11例，女9例；年齡（8.12±1.33）歲。本試驗經福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（2019-037-01）。

2 方 法

2.1 治療方法 內服醒鼻宣竅湯，藥物組成：蜜麻黃6 g，苦杏仁6 g，蒲公英15 g，辛夷9 g，白芷9 g，防風6 g，蟬蛻6 g，徐長卿9 g，蒼耳子9 g，川芎6 g，絲瓜絡10 g，甘草3 g。6 歲以上兒童采用此劑量，6 歲以下兒童中藥劑量酌情減少。藥物加減：風熱甚者可加金銀花、連翹；伴有咽癢者可加射干；喉核腫大者加玄參、皂角刺。中藥飲片由福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院負責統(tǒng)一采購及質量監(jiān)控，水煎服，每日1 劑，分次溫服。外用醒鼻凝膠滴鼻劑（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院院內制劑，閩藥制字Z20110006），每次每鼻孔1 滴滴鼻，早晚各1 次，連續(xù)治療4 周。

2.2 觀察指標

2.2.1 安全性指標 AR 患兒分別于治療前后檢測血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、電解質。

2.2.2 癥狀評分 參照《變應性鼻炎診斷和治療指南（2015 年，天津）》［1］癥狀評分標準，分別于治療前和治療后1、2、3、4 周評估癥狀改善程度。主要評價指標包括噴嚏、流涕、鼻癢、鼻塞、眼癢和異物感、眼紅和流淚等，患兒癥狀嚴重度按0～3 分進行評價，0 分為無癥狀；1 分為輕度癥狀（癥狀輕微，易于忍受）；2 分為中度癥狀（癥狀明顯，令人厭煩，但可以忍受）；3 分為重度癥狀（癥狀不能忍受，影響日常生活和/或睡眠）。

2.2.3 RNA-seq 和數(shù)據處理 ① RNA 抽提：治療前后采集血液2 mL，利用淋巴細胞分離液分離PBMC，Trizol 裂解液提取總RNA；② RNA 質檢：每個樣本取1 μL RNA 測量濃度，取300 ng 1%瓊脂糖進行電泳檢測，進行質檢；③ RNA 文庫構建：RNA樣品與探針雜交，分別進行RNA 片段化反應、第1鏈和第2 鏈cDNA 合成反應、接頭連接反應、PCR 反應、文庫擴增反應、Qubit 定量，2%瓊脂糖電泳文庫質檢；④ 數(shù)據處理：采用Illumina Hiseq 測序平臺進行高通量測序，利用Skewer 軟件和FastQC 軟件對預處理數(shù)據進行質量控制分析和統(tǒng)計。

2.2.4 qPCR 定量分析 上述樣本通過GO 功能、KEGG Pathway 及疾病關聯(lián)分析，在AR 患兒中發(fā)現(xiàn)了具有顯著差異的基因群和信號通路，為了進一步驗證RNA-seq 準確性，課題組從核心差異表達基因中篩選出與炎癥和過敏反應相關的基因，進一步擴大樣本進行qPCR 定量驗證絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Akt1）、B 淋巴細胞瘤-2 樣蛋白1（BCL2L1）、白細胞分化抗原36（CD36）、E1A 結合蛋白P300（EP300）、組蛋白脫乙酰基酶11（HDAC11）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、髓細胞增生蛋白（MYC）、人蛋白酶體α 亞基3 型（PSMA3）、非ATP 酶蛋白酶體26S 亞基6（PSMD6）、核受體共激活因子NCOA62抗體（SNW1 又名NCOA62 抗體）、轉錄輔抑制子4（TLE4）、Toll 樣受體1（TLR1）等基因，證實其差異性。于治療前后分別采集AR 患兒血液2 mL，分別進行總RNA 抽提、逆轉錄、熒光定量PCR 擴增（包括引物設計和PCR 反應）。序列參照Gene Bank 數(shù)據庫中各目的基因的序列，NCBI Primer-blast 設計引物，蘇州金唯智生物科技發(fā)展有限公司合成并提供引物，引物序列見表1。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內治療前后比較采用配對樣本t檢驗，組內不同時間點比較采用重復測量方差分析。

3 結 果

3.1 AR 患兒治療前后癥狀評分比較 AR 患兒治療后1、2、3、4 周與治療前比較，噴嚏、流涕、鼻癢、鼻塞、眼癢和異物感、眼紅和流淚等癥狀評分出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01），尤其在治療后4 周以上癥狀得到非常顯著的改善。見表2。

表2 AR 患兒治療前后癥狀積分比較（n=20，±s） 分

表2 AR 患兒治療前后癥狀積分比較（n=20，±s） 分

注：與治療前比較，1） P＜0.01。

治療后4周0.45±0.501）0.85±0.361）0.25±0.431）0.37±0.481）0.15±0.361）0.00±0.001）2.00±0.841）癥狀指標噴嚏流涕鼻癢鼻塞眼癢和異物感眼紅和流淚總分治療前2.55±0.50 2.95±0.38 2.10±0.62 2.40±0.58 1.95±0.80 0.85±0.48 14.10±2.00治療后1周1.85±0.481）2.20±0.511）1.45±0.591）1.60±0.581）1.25±0.771）0.40±0.491）9.60±2.761）治療后2周1.10±0.301）1.35±0.481）0.70±0.641）1.05±0.501）0.60±0.581）0.15±0.361）5.35±1.931）治療后3周0.80±0.401）1.00±0.451）0.40±0.491）0.70±0.711）0.15±0.481）0.00±0.001）3.10±1.261）

3.2 RNA-seq

3.2.1 整體基因表達水平比較分析 AR 患兒mRNA 和lncRNA 表達量豐度Boxplot 圖，一般來說FPKM≥0.1 表示轉錄本有表達，結果顯示AR 患兒轉錄組表達量FPKM 值均＞5，且各樣本表達量趨于一致。見圖1。

圖1 AR 患兒mRNA 和lncRNA 表達量豐度Boxplot 圖

3.2.2 差異表達基因篩選 AR 患兒中篩選出較多有差異的mRNA、lncRNA、cirRNA，根據|log2FC|≥1和P＜0.05 這2 個條件需同時滿足的前提下，篩選AR 患兒治療前后的差異轉錄本。共篩選出3 776個差異mRNA，火山圖中的紫色點和散點圖中的綠色點提示治療后較治療前下調基因點共有1 858個，火山圖中的藍色點和散點圖中的紅色點提示治療后較治療前上調基因點共有1 918 個。見圖2。

圖2 AR 患兒治療前后mRNA 火山圖和散點圖

共篩選出541 個差異lncRNA，火山圖中的紫色點和散點圖中的綠色點提示治療后較治療前下調基因點共有297 個，火山圖中的藍色點和散點圖中的紅色點提示治療后較治療前上調基因點共有244 個。見圖3。

圖3 AR 患兒治療前后lncRNA 火山圖和散點圖

共篩選出683 個差異cirRNA，火山圖中的紫色點和散點圖中的綠色點提示治療后較治療前下調基因點共有346 個，火山圖中的藍色點和散點圖中的紅色點提示治療后較治療前上調基因點共有337 個。見圖4。

圖4 AR 患兒治療前后cirRNA 火山圖和散點圖

3.2.3 目的基因集GO 功能分析 顯著富集GO 柱狀圖，針對目的基因集，采用TopGO 軟件進行GO 功能分析，對全基因和目的基因集進行功能注釋和歸類。見圖5。

圖5 顯著富集GO 柱狀圖

3.2.4 目的基因集顯著富集KEGG pathway 分析針對顯著富集mRNA、lncRNA、cirRNA 基因進行KEGG 數(shù)據庫中Pathway 的功能注釋和歸類，以下為顯著富集的KEGG pathway 柱狀圖。橫坐標代表顯著富集的KEGG pathway 名稱，縱坐標代表-log10（P值）。紅色柱表示顯著的Pathway 通路（P≤0.05），縱坐標越顯著表示該Pathway 越富集顯著。見圖6～圖8。

圖6 顯著富集mRNA KEGG pathway 柱狀圖

圖7 顯著富集lncRNA KEGG pathway 柱狀圖

圖8 顯著富集cirRNA KEGG pathway 柱狀圖

3.2.5 差異基因表達譜 AR 患兒治療后Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4等基因表達水平較治療前明顯下降（P＜0.05），HDAC11、MAPK1、MYC、TLR1 等基因表達水平較治療前明顯升高（P＜0.05）。見圖9～圖10。

圖9 治療 前后AR 患兒Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1 及TLE4 mRNA 表達水平比較

圖10 治療前后AR 患兒HDAC11、MAPK1、MYC及TLR1 mRNA 表達水平比較

3.3 安全性分析 AR 患兒治療前后血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、電解質等指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

4 討 論

AR屬于中醫(yī)學“鼻鼽”范疇，又名“鼽噴”“鼽嚏”“鼽水”等，關于該病的記載最早見于西周《禮記》。AR 患兒素體正氣不足，易為外邪所侵，風為百病之長，亦為陽邪，易襲陽位，風邪上犯，肺首當其沖。風性走竄，疏散不利，久病循經入里，內伏手太陰肺經而為伏風，外風引動伏風則發(fā)鼻鼽。鼻為肺之門戶，故風邪侵襲則出現(xiàn)鼻塞、鼻癢、噴嚏、流涕等癥狀，風邪留戀，故而時作時止，反復不愈，急性發(fā)作期可兼夾熱邪。因此，肺經伏熱是AR 急性發(fā)作期的關鍵病機，采用清宣醒鼻法治療AR 獲得顯著療效。

醒鼻宣竅湯來源于福建省名中醫(yī)鄭健教授的臨床經驗方，方中蜜麻黃宣發(fā)肺氣以承上，苦杏仁肅降肺氣以啟下，二者共為君藥，宣肅肺氣而通利鼻竅；蒲公英清熱解毒；辛夷發(fā)散風寒，通鼻竅；白芷祛風、燥濕、消腫；防風祛風解表；蟬蛻祛風止癢；徐長卿祛風通絡、止癢消腫；蒼耳子祛風通竅；川芎辛溫香竄，走而不守，引藥達病所；絲瓜絡行氣通絡、通利鼻竅；甘草調和諸藥。全方共奏疏風、醒鼻、宣竅之功，臨證每獲良效。中藥醒鼻方是福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院名老中醫(yī)黃守林主任根據多年的臨床經驗擬定的鼻腔局部專用經驗方，鄭健教授團隊已將其改良為醒鼻凝膠滴鼻劑，縱觀全方，辛開苦降、寒溫并用，具有疏風止癢、醒鼻開竅之功效［5］。本研究采用內服醒鼻宣竅湯聯(lián)合外用醒鼻凝膠滴鼻劑治療AR 患兒，獲得顯著療效，可明顯改善AR患兒鼻塞、鼻癢、噴嚏、流涕等癥狀，鼻炎癥狀積分明顯下降（P＜0.01）。

RNA-seq 是對特定標本的mRNA 進行研究，是一種無偏移的探究轉錄組基因功能和結構、識別分子通路的方法，對疾病發(fā)病機制和藥物治療關鍵靶點的探究具有重要意義。本研究采用RNA-seq 技術篩查AR 患兒特異性的差異基因表達，共篩選出3 776 個差異mRNA，治療后與治療前相比，上調基因1 918 個，下調基因1 858 個；篩選出541 個差異lncRNA，治療后與治療前相比，上調基因244 個，下調基因297 個；篩選出683 個差異cirRNA，治療后與治療前相比，上調基因337 個，下調基因346 個。通過GO 功能、KEGG Pathway 及疾病關聯(lián)分析，在以上篩選出的差異顯著基因群中，進一步篩選出與炎癥和變態(tài)反應相關的基因，為了進一步驗證RNA-seq 準確性，課題組擴大樣本進行qPCR 定量驗證，最終確定參與AR 慢性炎癥反應的基因：

Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、HDAC11、MAPK1、MYC、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4、TLR1 等。其中治療后Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4 等基因表達水平較治療前明顯下降（P＜0.05），HDAC11、MAPK1、MYC、TLR1 等基因表達水平較治療前明顯升高（P＜0.05），提示以上基因可能參與AR 的慢性炎癥反應，并且可能成為清宣醒鼻法治療AR 患兒的藥物作用關鍵靶點。