黑曲霉酸性果膠裂解酶在大腸桿菌中的表達和酶學性質研究

張海云,馬佳寧,李陽陽,陽鵬輝,宋偉艷,劉松

1(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)3(大連理工大學 化工學院,遼寧 大連,116024)

果膠酶是指能分解果膠物質的復合酶類,一般包括原果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶及果膠裂解酶等[1-3]。果膠裂解酶(EC 1.10.3.2)能夠以β-反式消去作用斷裂植物細胞中果膠的α-1,4糖苷鍵,形成不飽和寡聚半乳糖醛酸[2]。其中,酸性果膠裂解酶是指能在低pH條件下發揮作用的裂解酶,該酶在果汁、釀酒等工業中具有廣泛應用[4]。酸性果膠裂解酶主要來自于黑曲霉(Aspergillusniger)[5]、大豆曲霉[6]、黃曲霉[7]、假絲酵母[8]和釀酒酵母[9]等。然而,天然果膠裂解酶的耐酸性還有待提高[10-14]。構建高效、易操作的表達平臺是酸性果膠裂解酶分子改造的重要前提。

目前,酵母為酸性果膠裂解酶的主要表達宿主[15]。然而,酵母等真菌的基因操作周期長、菌體生長緩慢、效率低,不是酶分子改造的理想平臺[16-17]。與酵母等真菌表達體系相比,大腸桿菌Escherichiacoli具有發酵周期短、操作簡單的優良特性,是較為理想的重組蛋白生產改造的宿主細胞。此外,一些真菌(Penicilliumoccitanis[18]和A.niger[19-20]等)的酸性果膠裂解酶雖已在E.coli中表達,但無活性的包涵體是其主要存在形式。研究通過體外復性,可使40%的重組P.occitanis酸性果膠裂解酶包涵體重新折疊為可溶性活性蛋白[21]。然而,體外復性顯著增加了操作步驟,降低了酶蛋白制備效率[22]。

在E.coli中,蛋白標簽的融合可以提高蛋白質的溶解性[23]。常用來提高溶解性的蛋白標簽有碳水化合物結合結構域(carbohydrate-binding structural domain, CBM)、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein, MBP)、大腸桿菌硫氧還原蛋白(thioredoxins, TrxA)、谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase, GST)[24]。例如,有研究通過融合TrxA蛋白標簽策略優化了HIV-1蛋白酶(一種逆轉錄病毒天冬酰胺蛋白酶)在E.coli中的異源表達,表達量從0.83 mg/L提升到2.5 mg/L,有效提高了蛋白的溶解性[25-26]。

在本研究中,通過融合蛋白標簽CBM、MBP、TrxA、GST優化,提高來源于A.nigerAG11的酸性果膠裂解酶pelA(GenBank No.ANI_1_624124)在E.coliBL21(DE3)中的表達水平,構建pelA在E.coli中的分子改造平臺,并對其酶學性質進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

A.nigerAG11、E.coliJM109、BL21(DE3)感受態細胞、質粒pET-28a(+)、蛋白標簽CBM、MBP、TrxA、GST均由實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

柱回收試劑盒、蛋白質marker,Thermo公司;大腸桿菌感受態制備試劑盒、限制性內切酶、Primer STAR Max DNA聚合酶,大連TaKaRa公司;SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒、真菌基因組DNA快速提取試劑盒、一步克隆試劑盒、卡納青霉素、重組HRV 3C蛋白酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),上海生工公司;蛋白胨和酵母粉,Oxoid公司;底物柑橘果膠,美國Sigma公司;Bradford蛋白濃度檢測試劑盒,碧云天公司;蛋白電泳loading buffer和Bis-Tris預制凝膠,Invitrogen公司。其他常規試劑及藥品為國產或進口分裝。

1.1.3 培養基

LB(Luria-Bertani)液體培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,自然pH。

TB(terrific broth)培養基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,KH2PO4·3H2O 16.4,KH2PO42.31,甘油5,自然pH。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)培養基(g/L):葡萄糖20,土豆200,瓊脂15,自然pH。

上述培養基均121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1A.niger基因組的提取

將A.niger孢子懸液涂布于PDA培養基,在30 ℃下靜置培養4～7 d。加入無菌水刮取固體培養基表面上的孢子,經濾膜過濾后接種于PDB培養基中,30 ℃、220 r/min培養24 h。通過離心及紗布過濾收集菌絲體,置于滅菌的研缽中(加液氮)研磨至細小粉末,用離心管收集待用。A.niger基因組使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取。

1.2.2 PelA基因的克隆與表達載體的構建

以A.nigerAG11基因組為模板,通過NCBI中的BLAST對序列進行分析,編碼pelA的基因具有1 357 bp(包括4個內含子)。使用SignalP 5.0進行信號肽預測,pelA基因5′端有信號肽,可能會影響其在E.coli中的表達,故使用表1中的引物AF和AR進行PCR擴增,得到切除信號肽,但帶有內含子的pelA基因。擴增程序為:98 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸50 s;循環32次;最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,對產物進行純化并測序。使用NcoⅠ和XhoⅠ對pET-28a(+)載體和PCR產物進行雙酶切。使用Solution Ⅰ分別將PCR產物連接至pET-28a(+)載體的雙酶切片段,并轉化至E.coliJM109。按照表1所示引物,使用Aex2F、Aex2R、Aex3F、Aex3R、Aex4F、Aex4R、Aex5F、Aex5R對重組載體進行PCR以切除內含子。用磷酸化酶處理所得PCR產物,并使用Solution Ⅰ連接酶連接,得到pelA表達載體pET-28a(+)-pelA。將其轉化至E.coliJM109,挑取4～6個轉化子送公司進行測序驗證。將驗證正確的菌株重新活化培養12 h后,參考質粒提取說明書提取質粒,得到重組質粒pET-28a(+)-pelA。

1.2.3 重組pelA的表達

將構建的pET-28a(+)-pelA表達載體轉化至E.coliBL21(DE3),得到重組菌pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)。將重組菌接種于LB液體培養基(含50 g/L卡那霉素)中活化,37 ℃,220 r/min培養10 h。按照3%(體積分數)接種量轉接至TB發酵培養基(含50 g/L卡那霉素)中,在37 ℃,220 r/min搖床中培養至OD600約為1.0時,加入IPTG(終濃度為2 mmol/L)誘導表達,20 ℃、220 r/min培養24 h。

將重組菌發酵液離心并收集菌體,加入與發酵液等體積Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.0)重懸,置于冰水浴中超聲破碎。將超聲破碎儀的變幅桿末端插入樣品,在距離液面10～15 mm的中心位置固定,以間隙2 s、工作2 s為周期超聲處理4 min。整個超聲過程中樣品一直處于冰浴狀態。4 ℃、10 000 r/min離心20 min,分別測定菌裂解上清液和菌裂解液沉淀的酶活力,并對其進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 蛋白標簽優化提高胞內蛋白表達水平

為篩選蛋白標簽CBM、MBP、TrxA、GST,采用一步克隆法分別將蛋白標簽的基因序列融合到目的基因的5′端,使用表1所示引物進行PCR。基因操作參考1.2.2節的方法。挑取4～6個轉化子送公司進行驗證。將驗證正確的菌株重新活化培養12 h后,參考質粒提取說明書提取質粒,獲得重組質粒pET-28a(+)-pelA+CBM、pET-28a(+)-pelA+MBP、pET-28a(+)-pelA+TrxA、pET-28a(+)-pelA+GST。轉化進感受態細胞E.coliBL21(DE3)中,構成重組菌株pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+MBP/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+TrxA/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+GST/BL21(DE3)。培養方式參考1.2.3節。取菌裂解上清液測酶活力,比較不同蛋白標簽對pelA胞內表達的影響。

1.2.5 重組酶的分離純化

使用鎳親和層析柱(HisTrapTMFF)對重組酶pelA+CBM進行分離純化。緩沖液A:50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5;緩沖液B:50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L咪唑。取50 mL菌裂解上清液于0.22 μm 水系膜過濾后,上樣至用緩沖液A平衡的HisTrapTM FF。用5%的緩沖液B沖洗純化柱后,40%緩沖液B(含200 mmol/L咪唑)洗脫獲得重組酶pelA+CBM,用脫鹽柱Sephadex G25脫鹽,使用SDS-PAGE檢測其純度。

1.2.6 重組酶的酶學性質測定

對脫鹽后的重組pelA酶進行酶學性質分析。取出部分重組pelA+CBM酶,使用重組HRV 3C蛋白酶在4 ℃下處理16 h,以切除蛋白標簽CBM。再經過鎳親和層析柱對pelA進行分離純化,獲得純pelA。比較蛋白標簽切除前后的酶學性質的差異。

最適反應溫度:在pH 5.2條件下,測定不同反應溫度(30～80 ℃)下的酶活力,以最大的酶活力為100%。

溫度穩定性:將酶液置于不同溫度(30～80 ℃)處理2 h后,在標準條件下測定殘余酶活力,以未處理組的酶活力為100%。

最適反應pH:在最適反應溫度下,測定不同pH值(3.0～7.0)Na2HPO4-檸檬酸鹽緩沖液條件下的酶活力,使用相應pH值的緩沖液配制底物,以最大的酶活力為100%。

pH穩定性測定:將酶液置于不同pH值的(3.0～7.0)Na2HPO4-檸檬酸鹽緩沖液中,40 ℃條件下處理2 h,測定殘余酶活力,以未處理組的酶活力為100%。

1.2.7 重組酶的酶反應動力學參數測定

在酶的最適條件下測定質量濃度為0～5 g/L的柑橘果膠的初始酶活力。根據上述酶反應的數據,繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖,計算酸性果膠裂解酶的Km和kcat。

1.2.8 重組酶活力和蛋白含量的測定

采用HCl法測定酸性果膠裂解酶活力。將5 g/L柑橘果膠溶解于0.08 mol/L琥珀酸-琥珀酸鈉(pH 5.2)緩沖液中,用作底物。取2.9 mL底物,在30 ℃下預熱3 min后與100 μL適當稀釋的粗酶液混合,30 ℃反應30 min,加入1 mL的2 mol/L HCl終止液終止反應,在235 nm下測定其吸光度。1個標準酶活力單位定義為:在測定條件下,每分鐘生成1 μmol雙鍵所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。采用Bradford法測定酶蛋白濃度,蛋白標準品為牛血清蛋白。

1.2.9 統計學分析

本研究采用Origin 8.5軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey’s檢驗(P<0.05和P<0.01),實驗結果以平均值±方差表示。

2 結果與分析

2.1 產酸性果膠裂解酶重組菌株的構建及表達

以A.nigerAG11基因組為模板,獲得切除信號肽和內含子的pelA基因序列。電泳分析顯示,PCR產物的大小約為1 077 bp,符合理論值(圖1-a)。將PCR產物克隆至pET-28a(+)的NcoI-XhoI位點,得到編碼pelA的質粒pET-28a(+)-pelA’。基于一步克隆法切除pET-28a(+)-pelA’中pelA的內含子序列,進一步構建得到pelA表達質粒pET-28a(+)-pelA(圖1-b)。上述表達質粒序列均經測序驗證。

a-pelA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析;b-pET-28a/pelA載體圖譜

SDS-PAGE分析顯示,pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)菌裂解上清液與沉淀部分均有pelA條帶(理論量38.8 kDa),但空白對照菌裂解液沉淀部分不存在該條帶,菌裂解上清液隱約出現疑似pelA條帶,應為背景蛋白。初步判斷pelA在E.coliBL21(DE3)中成功表達,且大部分以包涵體形式存在(圖2-a)。對pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)和空白對照菌裂解上清液與沉淀分別測定酶活力,在空白對照的菌裂解上清液與沉淀中都未檢測到pelA活性,而在pET-28a(+)-pelA/BL21(DE)組的菌裂解上清液中檢測到0.79 U/mL的酶活力,其菌裂解液沉淀也不具有活性(圖2-b)。上述結果表明,pelA在E.coli成功表達,但主要以包涵體形式存在。大量研究表明,E.coli在表達外源蛋白時會抑制其在體內的過量表達,導致表達量降低、產生包涵體等,而將蛋白標簽與目的蛋白進行融合表達,可以明顯提高蛋白質產物的溶解性[21, 25-27]。因此,本研究采用融合蛋白標簽的方式來提高pelA的溶解性,便于對其性質進行研究及后期改造。

M:蛋白標準分子質量;1:pET-28a/pelA菌裂解液上清液;2:pET-28a/pelA菌裂解液沉淀;3:pET-28a(+)菌裂解液上清空白對照;4:pET-28a(+)菌裂解液沉淀空白對照a-重組菌表達pelA的SDS-PAGE分析;b-重組菌菌裂解液上清液和菌裂解液沉淀酶活柱狀圖

2.2 融合標簽優化提高pelA表達水平

將蛋白標簽MBP、TrxA、CBM、GST的基因序列分別融合到pelA基因的5′端,構建pET-28a(+)-pelA+MBP、pET-28a(+)-pelA+TrxA、pET-28a(+)-pelA+CBM和pET-28a(+)-pelA+ GST 表達載體(圖3-a)。將它們分別轉化至BL21(DE3)中,并在20 ℃,220 r/min下發酵24 h。分別測定菌裂解上清液中pelA的酶活力,結果顯示,蛋白標簽的融合均有提高pelA活性的作用。與重組菌pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)產pelA的胞內活性相比,重組菌pET-28a(+)-pelA+MBP/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+TrxA /BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+GST/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)的胞內活性分別提高了2.47、2.79、2.85、4.12倍。其中,重組菌pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)菌裂解上清液中酶活力最高,達到3.25 U/mL(圖3-b)。通過SDS-PAGE結果發現,與其他3種融合蛋白標簽(MBP、TrxA、GST)的蛋白條帶相比,融合CBM的菌裂解液沉淀蛋白條帶較細,而菌裂解上清液中的蛋白條帶較粗(圖3-c)。其中融合蛋白標簽MBP的菌裂解上清液蛋白條帶雖然很粗,但其活力不高,這可能是因為MBP標簽較大,對蛋白結構功能有影響。以上結果說明,蛋白標簽CBM能提高胞內表達量,有效減少包涵體的形成。而采用包涵體體外復性法,雖然使重組P.occitanis酸性果膠裂解酶的酶活力提高3.9倍[21],但蛋白制備過程繁瑣,且提高效果不如融合蛋白標簽CBM的方法。因此選取重組菌pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)對pelA酶進行表達。

M:蛋白標準分子質量;1:pelA+MBP菌裂解液上清液;2:pelA+MBP菌裂解液沉淀;3:pelA+TrxA菌裂解液上清液;4:pelA+TrxA菌裂解液沉淀;5:pelA+CBM菌裂解液上清液;6:pelA+CBM菌裂解液沉淀;7:pelA+GST菌裂解液上清液;8:pelA+GST菌裂解液沉淀(不同蛋白標簽重組酶用箭頭指出)a-重組蛋白標簽優化菌株表達載體構建;b-重組蛋白標簽優化菌株菌裂解液上清酶活力;c-蛋白標簽優化表達pelA的SDS-PAGE分析

2.3 重組pelA的酶學性質

2.3.1 重組pelA的純化和動力學參數測定

用0.22 μm的濾膜過濾菌裂解上清液,用40%的緩沖液B洗脫pelA+CBM,獲得目的蛋白條帶,蛋白條帶與理論值相符。取出一部分洗脫蛋白,用重組HRV 3C蛋白酶在4 ℃下處理16 h,切除蛋白標簽CBM,獲得目的蛋白條帶pelA,蛋白條帶符合理論值(圖4)。脫鹽后測定蛋白濃度和酶活力。

M:蛋白標準分子質量;1～2:30%B液洗脫pelA+CBM;3～5:40%緩沖液B洗脫pelA+CBM;6:酶切標簽后40%緩沖液B洗脫pelA

為了研究CBM對pelA催化性能的影響,測定了最適條件下pelA+CBM和pelA以柑橘果膠為底物時的動力學參數,其結果列于表2。結果顯示,pelA的Km是pelA+CBM的1.66倍,表明pelA+CBM對柑橘果膠底物的親和力比pelA的強。pelA的kcat/Km比pelA+CBM低48.81%,這表明切除CBM后pelA的催化效率降低。這些結果證明CBM可以提高pelA的催化效率,正如一些研究所證明的,CBM具有通過與底物特異性結合來增強底物與催化模塊長期接觸的鄰近效應作用,從而提高酶的催化效率[28-29]。

2.3.2 重組pelA的酶學性質測定

在30～40 ℃時,pelA+CBM 和pelA的相對酶活力均呈現上升趨勢。當溫度>40 ℃時,pelA的相對酶活力呈下降趨勢,而pelA+CBM相對酶活力在溫度>50 ℃時開始下降;反應溫度>70 ℃時,相對酶活力<40%,此時pelA+CBM的相對酶活力驟降,當溫度達到80 ℃時,相對酶活力低至40%以下(圖5-a)。以上結果說明40 ℃為pelA的最適反應溫度,而pelA+CBM的最適溫度為50 ℃。

a-不同溫度下酶的催化活性;b-不同溫度處理2 h的剩余酶活力;c-不同pH下酶的催化活性;d-不同pH處理2 h的剩余酶活力

將pelA+CBM和pelA分別置于不同溫度(30～80 ℃)孵育2 h后測定殘余酶活力。當在溫度為30～50 ℃時孵育2 h,pelA的相對酶活力保持在80%以上,說明該重組酶在30～50 ℃熱穩定性較好。但當該重組酶在溫度60 ℃時孵育2 h后,相對酶活力下降至40%以下。pelA+CBM在孵育溫度為30～70 ℃時均呈現較好的穩定性,但當溫度上升至80 ℃時,相對酶活力驟降,低于40%(圖5-b)。上述結果表明,CBM對pelA的熱穩定性有積極影響,這與研究表明的CBM具有提高酶穩定性的能力相契合[30]。

當反應體系在pH 4.0～6.0,pelA的相對酶活力均高于70%。在pH 5.0時測得最高酶活力,而當pH>6.0,酶活力下降至60%以下。pelA+CBM在pH 3.0～7.0均有60%以上的相對酶活力,且在pH 6.0時達到最高(圖5-c)。由此可知,重組酶pelA和pelA+CBM在酸性條件下均具有較好的酶活力。然而,當融合CBM時,pelA的最適pH從5.0升至6.0,推測與CBM具有提高酶的穩定性能力有關。

為測定pelA和pelA+CBM在不同pH條件下的耐受性,將其分別置于不同pH(3.0～7.0)的緩沖液中,40 ℃下孵育2 h后測定殘余酶活力。當pH 4.0～5.0時,pelA孵育2 h后相對酶活力保持在60%以上(圖5-d),該重組酶在酸性條件下具有較好的穩定性;而當pH>5.0時,相對酶活力開始下降,在pH為7.0時相對酶活力<35%。相反,pelA+CBM在pH為4.0～7.0時均有80%以上的相對酶活力,這個結果說明,CBM對pelA在中性或堿性環境下的穩定性有影響[30]。

3 結論

酸性果膠裂解酶作為一種能在酸性環境下裂解高酯化果膠的果膠酶,在果蔬汁食品產業、醫藥與天然產物的提取等方面有著重要的應用。E.coli作為常用的原核表達系統,擁有生長周期短、成本低、操作簡便等優勢,常被用來異源表達蛋白酶。然而酸性果膠裂解酶在E.coli中多以包涵體形式存在,雖然可以通過包涵體復性的方式提高其溶解度,但操作繁瑣,酶蛋白制作效率低,使E.coli無法作為酸性果膠裂解酶的分子改造平臺。對此,有研究者將酸性果膠裂解酶的分子改造在真菌或酵母中進行。但存在宿主生長緩慢,實驗操作步驟繁瑣以及改造周期長等問題。本研究成功構建了重組pelA在E.coli中的表達系統,通過N端融合蛋白標簽減少pelA包涵體的形成。該方法有效提高了蛋白溶解性,使pelA的表達量從0.79 U/mL提升至3.25 U/mL,便于對pelA進行純化及性質測定,同時降低酶蛋白制備成本,提高分子改造效率。此外,對E.coli產pelA的酶學性質進行測定,結果表示該酶在pH 4.0～6.0、30～50 ℃均有較好的穩定性,其最適反應溫度和最適反應pH分別為40 ℃和5.0。為了滿足實際生產時對耐酸性和熱穩定性的要求,可通過定向進化或理性設計對酶分子進行改造。本研究構建的酸性果膠裂解酶表達菌株成功使A.niger酸性果膠裂解酶在E.coli中表達,這為后續重組pelA的分子改造提供了重要的數據基礎。