代謝工程改造大腸桿菌生產氫咕啉酸

董寧,房歡,趙瑩,姜平濤,趙江華,4,張同存,張大偉*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)2(中國科學院天津工業生物技術研究所,低碳合成工程生物學重點實驗室,天津,300308)3(國家合成生物技術創新中心,天津,300308)4(中國科學院大學,北京,300192)5(工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津市工業微生物重點實驗室,天津科技大學生物工程學院,天津,300457)

維生素B12,又名鈷胺素,是唯一含有金屬元素的維生素,也是結構最復雜的維生素。其主要包括氰鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲鈷胺素和羥鈷胺素四類,其中腺苷鈷胺素和甲鈷胺素是生物體中具有活性的分子[1-2]。維生素B12只能通過細菌和古細菌生成,人體不能合成[3]。它是微生物代謝以及人類生長發育所必須的營養成分。工業生產維生素B12主要利用脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrifican)、弗氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudennreichii)和苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)等微生物發酵[4-6]。而近幾年通過合成生物學和代謝工程技術構建的大腸桿菌已經可以用來生產維生素B12[7-8]。維生素B12作為生物體中DNA、氨基酸代謝等重要的輔酶,已被廣泛應用于醫藥和食品行業。

氫咕啉酸(hydrogenobyrinic acid,HBA)外觀呈橙紅色,是維生素B12合成途徑中比較穩定的中間體[9],合成途徑如圖1所示。提高HBA的產量對維生素B12產量提高有至關重要的作用。我們前期構建了合成HBA的大腸桿菌工程菌[7-9],雖然產量較高,但是工程菌具有抗性,不利于生產。選擇穩定、表現良好的宿主細胞對于大規模生產目的分子至關重要[10]。輔因子和前體途徑優化、減少副產物合成是構建工業微生物生產菌株的常用策略[11-13]。

圖1 維生素B12生物合成途徑Fig.1 Vitamin B12 biosynthetic pathway

本研究選取了6種不同的大腸桿菌作為宿主,分別是BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12。將HBA合成質粒分別轉化到上述6種大腸桿菌宿主細胞中,發酵并進行HPLC檢測,發現BW25113(DE3)是最佳宿主。為了緩解質粒表達對菌株所帶來的代謝負擔,采取一系列代謝工程策略,如將HBA模塊整合到BW25113(DE3)基因組的hsdR基因位點,引入合成前體尿卟啉原Ⅲ模塊,敲除代謝副產物乙酸合成基因ackA-pta,引入苜蓿中華根瘤菌和運動發酵假單胞菌(Zymomonasmobilis)兩種來源的Entner-Doudoroff(ED)途徑提高還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)供給,得到了無抗生產HBA高產菌種,為下一步高產維生素B12工程菌的構建奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與質粒

論文中涉及的菌株見表1,質粒見表2。

表1 本實驗所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實驗所用質粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 引物

本實驗所涉及的基因序列均來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),使用Primer Premier 6或SnapGene設計所用引物,由北京擎科生物公司合成(表3)。

表3 本實驗所用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.3 主要培養基

LB(Luria-Bertani)液體培養基(g/L):蛋白胨10,酵母抽提物5,NaCl 10,pH 7.5,121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養基:在調好pH值的LB液體培養基加入15 g/L的瓊脂粉,121 ℃滅菌20 min。

TYGly培養基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、KH2PO45、甘氨酸2、甘油10、琥珀酸10、甜菜堿15,用NaOH調節初始pH值至7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

培養基在接種前按需添加相應抗生素,其中氨芐青霉素(ampicillin,Amp)質量濃度為100 μg/mL,硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate,Km)質量濃度為50 μg/mL,氯霉素(chloramphenicol,Cm)質量濃度為34 μg/mL。

1.1.4 儀器與設備

TC-XP-G PCR儀,BioER;EYETMII凝膠自動成像儀,法國VILBER LOURMAT;V-1600可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;DYY-6c電泳儀,北京市六一儀器廠;HPX-9162 MBE電熱恒溫培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;ND 2000 NanoDrop超微量分光光度計,Thermo Fisher;LDZX-50 KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBA合成途徑與宿主適配篩選

1.2.1.1 HBA合成質粒轉化不同宿主細胞

將BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12六種菌株做成大腸桿菌化學轉化感受態,將表達HBA合成途徑基因的質粒pET28-HBA[7]分別轉化這6種不同的大腸桿菌宿主細胞中,挑取長出的菌落用YZ-RCcobH-F,YZ-RCcobH-R引物進行驗證,正確的轉化子接入終質量濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中培養12～16 h后保藏。

1.2.1.2 菌株生物量的測定

采用紫外分光光度法測定大腸桿菌生物量。取100 μL菌液,用無菌水稀釋合適倍數,混勻后測定其在600 nm處的光密度(OD),測量生物量。待發酵結束后再次稀釋合適倍數測定大腸桿菌生物量。

1.2.1.3 發酵條件以及發酵樣品處理

從保藏這6種大腸桿菌的-80 ℃凍存管中取適量菌液分別劃線于含有卡那霉素的LB固體培養基進行活化,挑取新鮮的單菌落于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養基中,置于37 ℃、220 r/min搖床振蕩過夜培養。按照初始OD600值為0.05接種于含有終質量濃度為50 μg/mL卡那霉素的50 mL TYGly發酵培養基的三角瓶中,在37 ℃,220 r/min條件下培養,當OD600值增長到0.8時加入1 mmol/L誘導劑IPTG,并將溫度調至32 ℃誘導T7啟動子驅動的基因表達,待32 h發酵結束后進行發酵樣品處理。

使用5 mL移液器取發酵液10 mL于15 mL離心管中,4 000 r/min離心10 min棄上清液,并用移液器吸干殘留液體。加去離子水,定容至2 mL,混勻菌體。蓋好離心管蓋后,將離心管放置于滅菌鍋100 ℃處理30 min。取出離心管,4 000 r/min離心10 min,轉移上清液于1.5 mL EP管中。13 000 r/min離心10 min,用1 mL注射器吸取上清液,通過0.22 μm的水系濾膜過濾至新的1.5 mL EP管。最后,吸取200 μL樣品通過HPLC檢測HBA的含量。

在發酵3、6、12、18、24、30、36 h取樣稀釋,測量OD600值,繪制生長曲線。

在發酵6、12、18、24、30、36 h取樣700 μL,離心取上清液,通過0.22 μm的水系濾膜過濾至新的1.5 mL EP管。最后,吸取200 μL樣品通過HPLC檢測乙酸的含量。

1.2.1.4 HPLC定量檢測HBA

在安裝有Agilent SB-aq柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)的Agilent 1260液相色譜儀上進行分析。樣品進樣量10 μL。液相條件參考FANG等[7]文獻報道。所用流動相成分為:A相為1‰甲酸,B相為含有1‰甲酸的甲醇。流速1.0 mL/min,色譜柱溫度35 ℃,檢測波長329 nm。梯度洗脫條件:0～2 min,0～25% buffer B;2～4 min,25%～34% buffer B;4～12 min,34%～70% buffer B;12～17 min,70%～100% buffer B;17～23 min,100% buffer B;23～25 min,0～100% buffer B;25～27 min 0% buffer B。

1.2.1.5 HPLC定量檢測乙酸

在安裝有Bio-Red Aminex HPX-87H柱(7.8 mm×300 mm, 9 μm)的Agilent 1260液相色譜儀上進行分析。樣品進樣量20 μL。所用流動相成分:C相5 mmol/L H2SO4,流速0.5 mL/min,色譜柱溫度60 ℃。

1.2.1.6 酶標儀定量檢測ATP

在發酵6、12、18、24、30、36 h取樣200 μL,4 ℃、12 000 r/min離心2 min后棄上清液,采用上海碧云天生物技術有限公司ATP檢測試劑盒檢測,加入400 μL ATP裂解液進行重懸,靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心2 min,吸取上清液50 μL,滴入已在室溫放置5 min的含有100 μL ATP檢測工作液的Costar 96孔白色不透明板中,立刻混勻用Biotek Synergy HTX酶標儀進行發光檢測,根據標準曲線計算樣品中胞內ATP的濃度。按照文獻方法將OD600轉化為細胞干重(dry cell weight,DCW)并將ATP濃度換算成單位細胞干重的摩爾數[16]。

1.2.2 將HBA操縱子整合到基因組

將含有HBA合成途徑基因的質粒pCas9-hsdR-HBAD[7]轉化目的菌株BW25113(DE3),加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖誘導Cas9和λ噬菌體Red重組酶表達,誘導18 h后劃線到含有氨芐青霉素和阿拉伯糖的LB固體培養基的板子上,挑取長出的菌落進行驗證,驗證且測序正確后接入無抗的LB培養基中,轉移到42 ℃、220 r/min搖床進行傳代培養使質粒丟失,影印后對HBA操縱子整合的位點進行DNA測序,確保整合到目的菌株相應的位點。

1.2.3ackA-pta基因的敲除

根據文獻報道的同源重組結合CRISPR-Cas9的方法進行無痕敲除[17]。實驗室構建了敲除ackA-pta位點的Cas9質粒[7]。基因組上ackA-pta基因的上下游與相應的Cas9質粒上序列設計成一致。再將相應的Cas9質粒導入到目的菌株化學轉化的感受態中,分別挑取單菌落于5 mL含有終質量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素中,在30 ℃、200 r/min搖床培養2 h后,添加終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖進行誘導表達,誘導18 h后劃線于含有氨芐青霉素和阿拉伯糖的LB固體培養基的板子上,挑取長出的菌落用YZ-ackA-pta-F/R引物進行驗證,驗證且測序正確后接入無抗的LB培養基中,在42 ℃、220 r/min搖床進行傳代培養使Cas9質粒丟失后保藏。

1.2.4S.meliloti和Z.mobilis兩種來源的ED途徑的整合

ED途徑的整合采用標準化基因編輯方法進行(未發表)。在endA位點引入S.meliloti和Z.mobilis兩種來源的ED途徑,構建了pDonor01-endA-SmED、pDonor01-endA-ZmED和pCas9g-endA三個質粒。以引入S.meliloti來源的ED途徑為例,以MG1655基因組為模板,擴增endA基因的上下游,并膠回收純化,得到片段endA-up和endA-dn。將endA-up與質粒pMXLK-pFa進行Golden Gate組裝,將endA-dn與質粒pMXLK-bFq進行Golden Gate組裝,化學法轉化大腸桿菌DH5a菌株,藍白斑篩選涂板后,挑取白色單菌落進行驗證,正確的轉化子接入終質量濃度為50 μg/mL的卡那霉素中培養12～16 h提質粒并送測序,得到質粒pMXLK-pFa-endA-up和pMXLK-bFq-endA-dn。

以YX18基因組為模板,分別擴增edd、eda基因,膠回收純化,2片段與質粒pMXLK-aFb進行Golden Gate組裝后化學法轉化大腸桿菌DH5a,藍白斑篩選涂板,處理方法同上,得到質粒pMXLK-aFb-SmED。其與pMXLK-pFa-endA-up、pMXLK-bFq-endA-dn和pDonor01共4個質粒進行Golden Gate組裝,處理方法同上,得到質粒pDonor01-endA-SmED。引物endA-N20-F、endA-N20-R退火后與質粒pCas9gB進行Golden Gate組裝。處理方法同上,得到質粒pCas9g-endA。

向目的菌株中用電轉化的方法轉入pDonor01-endA-SmED、pCas9 g-endA,挑取單菌落于5 mL含有終質量濃度為100 μg/mL的氯霉素和50 μg/mL卡那霉素中,在30 ℃、200 r/min搖床培養2 h后,添加終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖進行誘導表達,誘導18 h后劃線到含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的LB固體培養基的板子上,挑取長出的菌落進行驗證,驗證且DNA測序正確后丟雙質粒后保藏。

2 結果與分析

2.1 氫咕啉酸合成途徑與宿主適配篩選

選擇合適的宿主是實現目的基因功能表達的關鍵,大腸桿菌因具有生長快和遺傳操作工具成熟等優勢而被廣泛應用。有文獻報道,大腸桿菌是合成維生素B12的前體5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)的優良菌種[18],具有代替傳統菌種生產維生素B12的潛力。由于HBA操縱子是T7啟動子驅動表達,這里以6種含有T7RNA聚合酶的大腸桿菌作為篩選對象,即BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12。將含有HBA合成途徑的質粒pET28-HBA[7]通過化學法轉化到這6種大腸桿菌中,進行發酵和HPLC液相檢測,如圖2-a所示。

a-不同宿主HBA產量;b-不同宿主生長情況

BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)作為宿主合成HBA的產量比較高,但是如圖2-b所示,生長曲線顯示它們的生物量過低,生物量太低會影響以后工業化生產。MG1655(DE3)作為宿主合成HBA的產量最低。BW25113(DE3)作為宿主的生物量和HBA產量都比較好,HBA的產量可以達到0.49 mg/L,OD600值為6.60。

2.2 HBA操縱子整合到染色體

為了避免質粒表達給菌株造成代謝負擔,利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術將HBA操縱子整合到BW25113(DE3)染色體hsdR位點上,菌株命名為BW01。將BW25113(DE3)和BW01進行發酵以及HPLC檢測,如圖3所示。BW01的HBA產量得到顯著提高,從0.49 mg/L增長到6.38 mg/L,提升了12倍;去除質粒后,細胞生長狀態有了明顯改善,OD600值從6.60增長到18.58。

圖3 HBA操縱子質粒表達與染色體表達菌株發酵結果Fig.3 Fermentation results of strains HBA operon expressed on plasmid or chromosome

2.3 加強前體供應

在此之前,我們對大腸桿菌進行了生產維生素B12的代謝工程研究,尿卟啉原III是HBA合成的重要前體物質[7]。為避免因工程菌株前體供應不充足,導致HBA的發酵質量濃度以及生產強度低下,通過優化前體尿卟啉原III供應來解除限制,進而提高大腸桿菌HBA合成能力。將生成尿卟啉原III的前體模塊整合到基因組PBAD位點,得到菌株BW02,進行發酵以及HPLC檢測,如圖4所示。HBA的產量從6.38 mg/L增長到11.61 mg/L,提高了82%,OD600值達到19.95。

圖4 加強前體供應的菌株HBA生產Fig.4 HBA production of strains with enhanced precursor supply

2.4 ackA-pta基因缺失

Pta-AckA途徑在大腸桿菌體內初級代謝過程中具有重要的作用[19],生成輔酶A,促進糖酵解和三羧酸循環,是生物體內能量代謝的重要組成部分。中間產物乙酰磷酸可以使丙酮酸轉化為乙酸,大腸桿菌好氧發酵時會積累乙酸。乙酸作為副產物持續累積可能對HBA產量有所影響[12]。所以敲除磷酸轉乙酰酶基因(phosphotransacetylase,pta)與乙酸激酶基因(acetokinase,ackA),破壞Pta-AckA途徑,得到BW03菌株。通過菌株搖瓶發酵和HPLC檢測,分析ackA-pta基因的失活對生長代謝和HBA產量的影響,如圖5-a和圖5-b所示。發現ackA-pta缺失后OD600值略有降低,乙酸生成量大幅降低,BW02、BW03菌株最大乙酸生成量分別為6.82和4.38 g/L。雖然敲除ackA-pta會降低乙酸積累量,但是對HBA合成不利,產量從11.61 mg/L下降到8.65 mg/L,可能因為敲除ackA-pta的同時,腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)供給減少,影響了合成HBA所需前體S-腺苷甲硫氨酸的合成。對2株菌的胞內ATP進行定量,如圖5-c所示,發現除了發酵6 h以外,敲除ackA-pta基因后ATP含量的確會有所降低。綜合來看,ATP比乙酸對HBA合成影響更大。因此放棄敲除ackA-pta,選擇BW02菌株進行后續改造。

2.5 兩種來源ED途徑的引入

糖酵解(embden-meyerhof-parnas,EMP)途徑、磷酸戊糖途徑、ED途徑和磷酸轉酮酶途徑是主要的碳代謝途徑[20]。ED途徑主要由兩個反應組成。第一個是由6-磷酸葡萄糖酸脫水酶(6-phosphogluconate dehydrase,EDD)催化,產生2-酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸(2-keto-3-deoxygluconic acid 6-phosphate,KDPG)。第二反應由酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸縮醛酶(keto-3-deoxygluconic acid -6- phosphate acetalase,EDA)催化,產生丙酮酸和甘油醛3-磷酸。與EMP途徑相比,ED途徑的蛋白質需求減少72%,同時提供的ATP減少一個[21]。EMP途徑只能合成NADH,不能合成NADPH,而ED途徑可以合成1個NADPH。從ALA每合成1分子維生素B12需要消耗10分子的NADPH[22]。大腸桿菌內源的ED途徑過弱,通過引入外源的ED途徑有可能提高維生素B12合成中間體HBA產量。

S.meliloti是天然生產維生素B12的菌株,為研究天然生產維生素B12菌株中ED途徑的引入對HBA產量的影響,構建了S.meliloti來源的ED途徑的質粒。有研究發現,在大腸桿菌MG1655中引入Z.mobilis來源的ED途徑,NADPH再生率提高了25倍[23],于是又構建了Z.mobilis來源的ED途徑的質粒。因此,選擇在BW02菌株endA位點分別整合S.meliloti來源和Z.mobilis來源的ED途徑,分別得到菌株BW04和BW05。以BW02菌株為對照菌株,發酵以及HPLC檢測,如圖6所示。

圖6 兩種來源ED途徑引入菌株的HBA生產Fig.6 HBA production of strains with two sources of ED pathways

由圖6可知,BW04產量有所下降,從11.61 mg/L下降到10.60 mg/L,分析原因可能是S.meliloti來源的ED途徑基因的基因表達水平不平衡導致的[24]。BW05的HBA產量從11.61 mg/L增加到14.60 mg/L。說明Z.mobilis來源的ED途徑引入對HBA產量的提高有較大幫助。

3 結論與討論

大腸桿菌是替代現有維生素B12生產菌種的非常有競爭力的菌種,利用無抗菌株生產維生素B12是未來的發展方向。本文在篩選最佳的合成HBA的宿主BW25113(DE3)基礎上采取多個代謝工程策略,整合HBA和前體合成途徑基因后HBA產量提高到11.61 mg/L,由于擺脫了質粒對宿主帶來的代謝負擔,OD600值從6.60提高到20.55。敲除乙酸合成基因ackA-pta不利于HBA合成,表達Z.mobilis來源的ED途徑基因后HBA產量最終達到14.60 mg/L。本研究所構建的無質粒重組菌發酵過程中無需添加抗生素,節省了產品分離提取的成本,對生產更有利,具有工業應用潛力。

大腸桿菌好氧發酵有2條產生乙酸途徑:一是在乙酸激酶(acetokinase,ACK)和磷酸轉乙酰基酶(phosphotransacetylase,PTA)作用下由乙酰CoA生成乙酸,主要在對數期起作用;另一條是在丙酮酸氧化酶的作用下由丙酮酸直接生成乙酸(PoxB途徑),主要在對數后期和平臺期其作用[25]。直接敲除ackA-pta不利于HBA合成暗示對于乙酸代謝途徑的控制要和HBA合成對ATP的需求相協調,這樣才能達到既控制了乙酸積累量又提高HBA產量。由于合成HBA需要消耗大量NADPH,引入了Z.mobilis和S.meliloti來源ED途徑,但表達S.meliloti來源ED途徑基因后HBA產量有所下降,從11.61 mg/L下降到10.60 mg/L,分析原因可能是S.meliloti來源的ED途徑基因的基因表達水平不平衡導致的。

本研究在乙酸代謝和ED途徑進行了初步改造,接下來工作包括:為避免敲除基因影響過大,精準弱化ackA-pta或poxB基因,平衡乙酸生成和ATP供給;弱化糖酵解途徑以提高ED途徑代謝流,為維生素B12合成提供充足的NADPH;繼續在染色體上整合維生素B12下游合成途徑基因獲得生產維生素B12的工程菌。