凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對小鼠潰瘍性結腸炎的保護作用

高涵,吳影,2,3,鐵珊珊,2,趙麗娜,2,李欣,2,3,曹力,3,古紹彬,2,3*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471000)2(河南省食品微生物工程技術研究中心,河南 洛陽,471023)3(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心,河南 洛陽,471023)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種主要發生在結腸的慢性非特異性炎癥性腸病,其發病率在全球范圍內逐年上升[1]。UC患者的臨床癥狀主要表現為體重下降、腹痛及血性腹瀉,其發病與地理、年齡、性別、遺傳和環境因素有關[2],但確切的發病機制尚未完全確定。近年研究發現腸黏膜機械屏障在UC的發病機制中起重要作用,例如抗氧化能力及免疫炎癥因子失衡造成結腸黏膜屏障不同程度受損,腸上皮細胞大面積凋亡,導致局部腸道環境發生病變,加快UC進程[3]。基于UC的無法治愈性,UC患者通常需終身服用美沙拉嗪等藥物,但其仍具有一定的毒副作用,因此,探索可預防UC健康無副作用的益生菌制劑成為新的研究熱點[4]。

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是益生菌中一類兼具乳酸菌和芽孢桿菌特征、革蘭氏陽性的桿狀細菌,已先后在多種動物腸道及糞便[5]中分離獲得。當凝結芽孢桿菌的生長條件惡化時,會從營養細胞轉化為具有良好抗逆性的芽孢,其芽孢耐酸、耐膽鹽,可在胃腸道中存活及定植[6],從而降低腸道pH,抑制有害菌滋生,起到調節人體腸道健康、提高消化能力及免疫力等益生作用[7]。此前,已有多項研究證實凝結芽孢桿菌對結腸炎有緩解效果,FITZPATRICK等[8]發現凝結芽孢桿菌BC30改善了艱難梭菌誘導的小鼠結腸炎,減輕了小鼠腹瀉癥狀;SASAKI等[9]采用模型培養系統構建體外人結腸微生物群,發現凝結芽孢桿菌SANK 70258增加了毛螺菌科相關細菌,使受試者的微生物群模型中產生了更多具有健康益處的丁酸鹽;SHINDE等[10]利用綠色香蕉抗性淀粉與凝結芽孢桿菌MTCC 5856作為合生元,發現其對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的小鼠結腸炎有明顯緩解作用。據研究[11],包括凝結芽孢桿菌在內的乳酸菌可能通過消除腸道自由基、產生多種有機酸修復腸道損傷。但目前對于凝結芽孢桿菌干預UC患者腸道氧化應激反應及腸道機械屏障的系統性研究甚少。

前期研究發現,凝結芽孢桿菌CGMCC 9951具有良好的益生性能[5]。因此,本研究以DSS誘導的小鼠結腸炎為模型,系統性探討凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對結腸炎小鼠腸道氧化應激、免疫炎癥及腸道機械屏障等保護效果,為凝結芽孢桿菌CGMCC 9951干預結腸炎提供科學依據,從而促進凝結芽孢桿菌CGMCC 9951在食品、醫藥等不同領域的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951,由河南科技大學食品與生物工程學院微生物育種與代謝調控研究室前期分離保藏。經活化后制備種子液,于5 L發酵罐中37 ℃發酵96 h,取發酵液混入質量分數5%的玉米淀粉,于160 ℃噴霧干燥制為菌粉。

1.2 試劑與儀器

DSS,上海翌圣生物科技股份有限公司;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、乳酸、總蛋白檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-10測試盒、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)檢測試劑盒,上海科艾博生物技術有限公司;二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)檢測試劑盒,江蘇連云港伊勢久生物科技有限責任公司;多聚甲醛固定液,北京蘭杰柯科技有限公司。

Multiskan FC酶標儀,美國Thermo Fisher(賽默飛世爾)公司;D3024R臺式高速冷凍離心機,美國Scilogex(賽洛捷克)公司;L5S型紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

準確稱取凝結芽孢桿菌CGMCC 9951菌粉1 g于10 mL 0.85%無菌生理鹽水中,得到3×108CFU/mL菌懸液,之后用無菌生理鹽水逐級稀釋得到3×107、3×106CFU/mL菌懸液。配制完成后,4 ℃冷藏備用。

1.3.2 動物實驗設計

健康昆明雄性小鼠30只(n=6只/組),鼠齡12周,體質量(30±2) g,飼養于12 h光照12 h黑夜交替循環,溫度(24±2) ℃,濕度(50±10)%的環境中。

實驗小鼠自由飲食適應性喂養7 d后,隨機分為對照組、模型組、CGMCC 9951低、中、高劑量組。隨后,對各組小鼠進行實驗:對照組與模型組每日灌胃0.85%無菌生理鹽水0.3 mL,低、中、高劑量組每日分別灌胃3×106、3×107、3×108CFU/mL CGMCC 9951菌懸液0.3 mL,灌胃2周。在第3周,除對照組外,其他各組小鼠均自由飲用5%DSS水溶液誘發急性結腸炎。實驗結束后,小鼠禁食12 h后處死小鼠,采集血清、結腸組織等樣品,用于后續相關指標的測定與分析。動物實驗設計方案如表1所示。該研究內容和過程遵循國際及國家頒布的有關生物醫學研究所制訂的倫理學標準[SYXK-(豫)2018—0010]。

表1 動物實驗設計方案Table 1 Animal experiment design

1.3.3 疾病活動指數(disease activity index, DAI)的測定

實驗期間,每日觀察小鼠精神及活動狀況,并于固定時間點稱量小鼠體重及飼料,計算小鼠體重下降比與日均攝食量。另外,從實驗第3周開始每日注意觀察小鼠的糞便性狀,根據SHICHIJO等[12]的評分方法,計算得出小鼠DAI評分,具體評分項目如表2所示。

表2 疾病活動指數評分Table 2 Disease activity index score

1.3.4 結腸長度的測定

處死小鼠后,從小鼠回盲瓣至肛門取得整段結直腸組織,測量其長度,做好記錄。

1.3.5 病理組織H&E染色

剪取小鼠結腸0.5 cm放入4%多聚甲醛中固定,采用95%乙醇脫水,之后使用二甲苯洗脫結腸組織中的乙醇,將組織包埋于石蠟中,冷卻后切片,采用H&E染色法染色,于光學顯微鏡下觀察結腸組織上皮細胞病變、隱窩損傷、炎癥浸潤等病理情況,并參照WALLACE等[13]的方法進行組織學評分,評分標準見表3。

表3 小鼠結腸病理組織學評分Table 3 Mouse colon histopathological scoring

1.3.6 結腸組織氧化應激程度的測定

準確稱取結腸組織樣本0.1 g于0.9 mL生理鹽水中,冰水浴條件下機械勻漿充分后,在4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清至1.5 mL離心管中,獲得結腸組織勻漿,放于-80 ℃保存。隨后根據試劑盒說明書對組織勻漿樣本中的T-SOD、GSH及MDA的含量進行測定。

1.3.7 血清炎癥反應的測定

將血液樣本在4 ℃、4 000 r/min離心15 min,獲得血清,放于-80 ℃保存。嚴格按照酶聯免疫吸附試劑盒說明分析血清中IL-10、TNF-α、IL-1β含量。

1.3.8 結腸腸道通透性的測定

小鼠血清中LPS含量及結腸組織勻漿中DAO含量可作為評判結腸腸道通透性的指標。依照相關試劑盒操作指示取血清測定LPS含量;根據DAO試劑盒說明書制備結腸組織粗酶液,測定DAO含量。

1.4 數據統計及分析

使用Origin 2021軟件繪圖;實驗數據以平均值±標準誤表示,采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析或克魯斯卡爾-沃利斯統計分析,其中P<0.05認為具有統計學差異,P<0.01認為差異具有顯著性,P<0.001認為差異具有極顯著性。

2 結果與分析

2.1 CGMCC 9951對結腸炎小鼠癥狀的影響

以DSS誘導的UC小鼠模型在建模后表現為精神萎靡、毛發暗淡、攝食減少、血性腹瀉以及結腸損傷,進而影響小鼠體重、攝食、結腸長度和DAI評分的變化。由圖1所示,在本實驗第1、2周內,CGMCC 9951的低、中、高干預組、模型組與對照組小鼠的日均攝食量和體重減輕比不存在顯著差異;在第3周,除對照組外,各組經5%DSS處理后,小鼠日均攝食量及體重呈不同程度下降,其中模型組體重下降最為顯著。實驗結束時,相比對照組,模型組小鼠體重顯著下降(P<0.05),達24.25%。而與模型組相比,中劑量組和高劑量組緩解了結腸炎小鼠的體重下降(P<0.05),使小鼠體重增加了9.15%及8.59%。

a-攝食量;b-體重下降比

由圖2可知,與對照組相比,模型組小鼠DAI評分在造模期內極顯著升高(P<0.001),表明結腸炎模型建立成功;與模型組相比,高劑量組DAI評分降低53.33%(P<0.05),說明高劑量CGMCC 9951能明顯減輕由DSS引起的便血、糞便松散等癥狀。

圖2 各處理組小鼠DAI評分Fig.2 DAI score of mice in each treatment group

如圖3-a所示,與對照組相比,模型組結腸長度呈顯著下降趨勢(P<0.001),表明小鼠結腸受到損傷而縮短;而與模型組相比,中劑量、高劑量組結腸長度分別增加了27.12%(P<0.05)和38.55%(P<0.01)。表明中劑量及高劑量的CGMCC 9951干預可改善UC造成的結腸縮短癥狀,從而減緩UC進程。脾臟作為機體最大的淋巴器官,不斷參與到免疫應答反應中。當機體發生炎癥反應時,脾臟由于更多免疫調節的發生而腫脹,造成其質量的增加。由圖3-b可知,模型組與對照組相比脾臟指數顯著增加(P<0.05),而經CGMCC 9951保護的中劑量、高劑量組小鼠脾臟指數相比模型組顯著降低(P<0.01)。以上實驗結果表明中劑量及高劑量CGMCC 9951可顯著改善UC癥狀。

a-結腸長度;b-脾臟指數

2.2 CGMCC 9951對結腸炎小鼠病理組織的影響

通過對小鼠結腸組織進行H&E染色和組織學損傷評分,以評估CGMCC 9951對DSS誘導的UC小鼠結腸結構和形態的影響。如圖4-a和4-b所示,對照組小鼠的結腸完整,上皮細胞正常,隱窩結構清晰,杯狀細胞明顯;而經DSS誘導后,模型組小鼠的結腸腸上皮細胞損傷明顯,隱窩結構部分缺失,炎癥浸潤程度較高,病變范圍高(P<0.001)。高劑量組小鼠結腸黏膜上皮結構十分完整,炎癥細胞浸潤程度低,病變深度主要在黏膜下層,隱窩病灶范圍較小,與模型組組織學評分相比下降了46.43%(P<0.05)。結果表明高劑量CGMCC 9951顯著減少了DSS誘導的小鼠結腸組織損傷,在一定程度上保護腸道上皮細胞,減輕小鼠UC炎癥程度,維持腸黏膜完整性。

a-結腸病理組織切片;b-組織學評分

2.3 CGMCC 9951對結腸炎小鼠結腸氧化應激程度的影響

DSS誘導的UC通常伴有結腸環境大量活性氧的產生,導致小鼠體內氧化還原系統失調,即引發了氧化應激反應,對結腸組織造成不同程度的炎癥損傷[14-15]。GSH是機體重要的自由基清除劑,組織內GSH濃度較高,使細胞損傷減少,同時使機體各種免疫細胞得到充分的活化與分化,增強免疫力[16]。如圖5-a所示,與對照組相比,模型組GSH含量極顯著下降(P<0.001),證實DSS誘導會導致小鼠抗氧化防御系統功能異常。經低、中、高劑量CGMCC 9951干預后的小鼠GSH含量均極顯著升高(P<0.001),其中高劑量組升高最顯著,達181.89%,說明小鼠腸道氧化應激程度得到有效緩解。T-SOD是參與保護組織免受氧化損傷的重要抗氧化酶之一,可將活性氧分解為O2和H2O2,抑制結腸組織中的脂質過氧化反應[17]。如圖5-b所示,其含量變化與GSH趨勢一致,中、高劑量組相比模型組酶活性顯著升高22.80%及48.73%(P<0.01)。MDA是脂質過氧化的產物,可反映機體內脂質過氧化的程度,通常與T-SOD的測定相配合,間接反映組織細胞受損傷程度。如圖5-c所示,實驗結果表明,與模型組相比中劑量組和高劑量組MDA含量差異性降低53.35%及55.41%(P<0.05)。該實驗結果表明CGMCC 9951可減少小鼠結腸的氧化損傷程度。

a-GSH含量;b-T-SOD含量;c-MDA含量

2.4 CGMCC 9951對結腸炎小鼠炎癥因子的影響

當發生UC時,機體會處于應激狀態,誘發多種炎癥因子參與到免疫反應中,從而促進炎癥反應的進程。機體的免疫細胞通過TLR4/NF-κB等信號通路[18]的激活,釋放促炎因子(TNF-α、IL-1β)[19-20],從而促進UC。如圖6所示,模型組相比對照組TNF-α及IL-1β含量上升(P<0.05),表示DSS誘導后加劇了小鼠體內的炎癥反應。而與模型組相比,中、高劑量組小鼠TNF-α下降20.91%(P<0.05)及24.87%(P<0.01),表明中、高劑量CGMCC 9951能夠有效抑制小鼠體內促炎因子的升高。抗炎因子IL-10含量在實驗中與促炎因子呈相反趨勢,中、高劑量組IL-10濃度的顯著上升36.46%及46.81%說明小鼠體內的炎癥擴散得到有效控制(P<0.05)。該實驗結果表明CGMCC 9951可通過調節免疫炎癥因子控制炎癥反應的加劇。

a-TNF-α含量;b-IL-1β含量;c-IL-10含量

2.5 CGMCC 9951對結腸炎小鼠腸道通透性的影響

腸道通透性的增加是結腸炎發生的重要標志,表明腸道機械屏障的完整性遭到破壞。研究表明,腸黏膜通透性會隨著腸道炎癥的增加而顯著增加[21]。當腸黏膜受到損傷,導致腸道內外多種炎癥性疾病的發生及腸道通透性增加,進而影響腸道機械屏障。因此,改善腸道通透性是緩解UC的有效途徑之一。本實驗中,利用LPS濃度和DAO活力來評估小鼠結腸機械屏障的完整性。腸黏膜受損導致腸道通透性增加,致使腸道內革蘭氏陰性菌產生的LPS通過腸上皮進入血液,進而引發全身炎癥。如圖7-a所示,模型組相較對照組血清LPS升高(P<0.05),說明DSS誘導的結腸炎小鼠腸道通透性增加,腸道機械屏障遭到破壞。模型組相比,高劑量組LPS含量下降16.57%(P<0.05),證明經高劑量CGMCC 9951干預保護的小鼠腸黏膜損傷減輕,腸道通透性未受明顯影響。DAO可催化多胺氧化為醛,與核酸和蛋白質的合成密切相關,常被臨床上用來反映腸道機械屏障的受損程度。如圖7-b所示,模型組DAO活力較對照組顯著下降(P<0.05),而高劑量組DAO活力較模型組顯著上升74.49%(P<0.05),表明高劑量組小鼠腸道機械屏障受到CGMCC 9951保護,較為完整。該實驗結果證實CGMCC 9951通過維持小鼠腸道機械屏障的完整性預防結腸炎。

a-LPS濃度;b-DAO活力

3 結論與討論

UC是一類慢性、易反復發作的炎癥性腸病,可能與腸道通透性增加、腸道菌群失調、免疫功能下降及炎癥因子失衡等因素有關。本研究以不同劑量的凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對小鼠進行灌胃,之后采用5% DSS誘導結腸炎,探討CGMCC 9951對結腸炎小鼠病癥的干預作用,主要表現為:(1)CGMCC 9951能顯著改善結腸炎小鼠的攝食量及體重下降、結腸長度縮短、DAI評分和結腸組織損傷等;(2)CGMCC 9951通過調節結腸炎小鼠體內氧化與抗氧化作用失衡、影響炎癥因子水平,改善小鼠的炎癥反應;(3)CGMCC 9951還可通過控制小鼠腸道通透性的增加,從而維護結腸炎小鼠腸道機械屏障的完整性。

UC患者通常存在腸道菌群失調,外源性益生菌通過調節內源性菌群和免疫系統來改善局部微生物環境,從而減輕相關疾病。MAYER等[22]指出,益生菌可通過產生抗菌物質以控制腸道中有害菌的數量;BERMUDEZ-BRITO等[23]發現益生菌常常通過抑制TLR4/NF-κB信號通路和PI3K/AKT/NF-κB信號通路,調節免疫細胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ等釋放,以降低炎癥程度,并指出益生菌可影響腸道上皮黏膜的緊密連接蛋白來調節腸道通透性,從而保護腸道屏障的完整性。JOYCE等[24]研究得出益生菌通過調節腸道菌群,降低致病微生物豐度,進而影響膽汁酸代謝,緩解UC。多項臨床研究表明,凝結芽孢桿菌作為益生菌對UC具有良好的保護作用。李飛[25]研究發現,凝結芽孢桿菌TBC-169是凝結芽孢桿菌活菌片的有效成分,進入腸道后分泌大量乳酸、乙酸等有機酸的同時產生多種細菌素以修復腸道損傷;激活免疫細胞調節炎癥因子的釋放以改善免疫系統失衡,從而達到防治UC的作用。此前關于凝結芽孢桿菌干預UC的研究大多圍繞炎癥因子調節、腸道菌群變化等,對凝結芽孢桿菌干預機體氧化應激反應及維護腸道機械屏障研究較少。基于此,本研究重點探討了凝結芽孢桿菌CGMCC 9951對UC小鼠炎癥反應、結腸氧化應激反應及腸道機械屏障的干預效果,結果表明CGMCC 9951不但具有與凝結芽孢桿菌TBC-169調節機體炎癥反應作用的相似功能,還表現出有效改善結腸氧化與抗氧化失調、維系腸道機械屏障完整的能力。

綜上所述,凝結芽孢桿菌CGMCC 9951具有改善DSS誘導的功效,可緩和UC導致的體重降低、結腸長度縮短、DAI增加等表現,減輕UC相關癥狀與小鼠結腸組織的病理變化。此外,CGMCC 9951可減弱DSS誘導的結腸氧化應激損傷,調節UC小鼠血清炎癥因子水平,且對腸道機械屏障損傷及結腸通透性降低具有緩解作用。因此,本研究為凝結芽孢桿菌CGMCC 9951作為高效干預UC的益生菌制劑相關營養食品開發和使用提供了基礎支持。