麥盧卡蜂蜜促健康功能研究進展

沙芳芳,趙瑞麗,張璐*,范沛*

1(河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州,450001)2(河南工業大學學報編輯部,河南 鄭州,450001)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結合后,經充分釀造而成的天然甜物質(GB 14963—2011《食品安全國家標準 蜂蜜》)。蜂蜜被人們用作食品和保健品已經有悠久的歷史[1]。隨著科學研究的不斷深入,蜂蜜的活性成分和營養價值也不斷被挖掘。在當前全球大健康產業(營養食品和保健用品是重要的領域和環節)快速發展的背景下,蜂蜜的促健康功能越來越受到關注和重視。蜂蜜的主要成分是果糖和葡萄糖(占約70%),同時亦含有蛋白質、氨基酸、脂類、黃酮類、酚酸類、有機酸、維生素、礦物質和揮發性化合物等成分,雖然這些物質總體含量較少,但分子種類很多(200種左右)[2],是蜂蜜中關鍵的風味和活性決定因子。不同蜂種、蜜源和產地生產的蜂蜜在成分、口感和生物學功能方面存在差異,因此形成了具有不同地域特色的蜂蜜。近年來,我國進口蜂蜜量價齊升。據《2022—2028年中國蜂蜜行業市場競爭狀況及發展趨向分析報告》的數據顯示,2021年我國進口蜂蜜突破1億美元,價格為21 879美元/t,是我國出口蜂蜜價格(1 783美元/t)的12.3倍。新西蘭蜂蜜年進口量一直位列第一[3],其中麥盧卡(Manuka)蜂蜜是最具代表性的產品,其蜜源來自新西蘭本土植物麥盧卡樹(Leptospermumscoparium)[4]。麥盧卡蜂蜜根據質量等級分類,每250 g售價可從幾百元到數千元人民幣。為此人們基于這款新西蘭特色蜂蜜進行了大量的成分特征和促健康功能研究。本文對麥盧卡蜂蜜的抗病原微生物機理、調節炎癥模式、抗損傷效應、抗腫瘤機制,以及對神經系統功能的影響進行了綜述,以期對其科學利用提供依據。

1 麥盧卡蜂蜜的成分特征

1.1 碳水化合物

每100 g麥盧卡蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量分別為39.2和30.7 g,果糖/葡萄糖比值較低,約為1.3。而產自澳大利亞的瑪里紅桉蜂蜜(Marri honey)和凱瑞蜂蜜(Karri honey)果糖/葡萄糖比值分別達到1.6和1.5[5]。果糖/葡萄糖比值決定了蜂蜜的結晶程度(該值越高,越不容易結晶),結晶蜂蜜具有獨特的質地和口感,因而受到不少人喜愛。碳水化合物中維持較為平均的果糖/葡萄糖比值更容易被人體吸收[6],較高的果糖/葡萄糖比值則促進肝細胞產生屬于血脂成分的甘油三酯和膽固醇[7]。

總二糖和寡糖在麥盧卡蜂蜜中所占比例可達10.73 g/100 g,其中蔗糖1.43 g/100 g、麥芽糖2.35 g/100 g、黑曲霉糖2.43 g/100 g、曲二糖1.57 g/100 g、潘糖1.66 g/100 g[8]。在凍干處理的麥盧卡蜂蜜寡糖粉末中,還檢測到了吡喃葡糖基蔗糖和麥芽三糖,并且研究發現,這些寡糖有助于抑制細菌與宿主細胞之間的黏附作用[9],可降低病原菌感染幾率;而另一方面,蜂蜜中的寡糖成分可參與調節腸道功能和腸道菌群[10]。

1.2 黃酮類和酚酸類化合物

黃酮類和酚酸類化合物是蜂蜜中的關鍵活性成分,屬于植物的次級代謝產物,在蜜蜂采蜜過程中由植物帶入蜂蜜。黃酮類和酚酸類化合物具有顯著的抗炎、抗腫瘤和抗衰老等藥理學功效[11-13],兩者在麥盧卡蜂蜜中均具有較高含量。

麥盧卡蜂蜜中總黃酮類化合物含量可達3.764 mg/100 g(以兒茶素為內參物),而澳大利亞的藿香蜂蜜和茶樹蜂蜜,總黃酮類化合物含量分別為2.667和2.008 mg/100 g[14],低于麥盧卡蜂蜜。麥盧卡蜂蜜中主要黃酮類分子是槲皮素(0.43 mg/100 g)、異鼠李素(0.40 mg/100 g)、白楊素(0.38 mg/100 g)和木犀草素(0.38 mg/100 g)[另包括一種未知黃酮類分子(0.39 mg/100 g)],這5種分子含量占總黃酮類化合物的64.6%,其它被檢測到的微量黃酮類分子有楊梅素、山奈酚和喬松素等[15]。也有研究表明麥盧卡蜂蜜的主要黃酮類分子是短葉松素(0.27 mg/100 g)、喬松素(0.17 mg/100 g)、木犀草素(0.14 mg/100 g)和白楊素(0.13 mg/100 g),占總黃酮類物質的61%[16]。兩研究中木犀草素和白楊素均檢測到較高含量,說明二者是麥盧卡蜂蜜中重要的黃酮類分子。

麥盧卡蜂蜜中總酚酸類化合物含量一般介于100 mg/100 g～300 mg/100 g(通常以Folin-Ciocalteu法測定、沒食子酸為內參物)[14,17-18],屬于較高水平,高于澳大利亞藿香蜂蜜(85.36 mg/100 g)和茶樹蜂蜜(126.35 mg/100 g)[14]。早期有研究(非Folin-Ciocalteu法)表明麥盧卡蜂蜜中總酚酸類化合物含量為14.0 mg/100 g(高于澳大利亞澳洲茶蜂蜜的5.14 mg/100 g),其中主要的酚酸類分子是沒食子酸(7.05 mg/100 g),占總酚酸類化合物含量的50%左右。其它含量較高的酚酸類分子包括鞣花酸(1.50 mg/100 g)、咖啡酸(1.43 mg/100 g)和一種未知酚酸類分子(1.62 mg/100 g),綠原酸和阿魏酸含量較低[15]。隨后4-羥基苯甲酸、丁香酸、異阿魏酸和對香豆酸也被證實存在于麥盧卡蜂蜜中[16,19]。麥盧卡蜂蜜還含有部分酚酸類分子的衍生物。例如,丁香酸甲酯及其糖苷花含線葉金雞菊甙,后者僅存在于產自大洋洲的蜂蜜中,可作為麥盧卡蜂蜜的檢測標志物[20]。

麥盧卡蜂蜜中亦含有其它含苯環有機酸,含量較高的有苯乙酸(72.7 mg/100 g)、苯乳酸(66.1 mg/100 g)和4-甲氧基苯乳酸(41.7 mg/100 g)[19]。含苯環的有機酸(例如苯乳酸、2-甲氧基苯甲酸和4-羥苯基乳酸)通常用于麥盧卡蜂蜜真偽的鑒定[21];含有雜環的有機酸,含量較高的是脫落酸(32.8 mg/100 g)[15],也含有一定量的曲酸(1.7 mg/100 g)[19]。這些有機酸可直接影響麥盧卡蜂蜜的pH值,而較低的pH值是其抑制細菌生長的因素之一。

1.3 甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)

麥盧卡蜂蜜含有高濃度的MGO。MGO是重要的抗菌活性物質之一,也是麥盧卡蜂蜜質量等級標準的劃分依據,通常以外包裝上標注的“MGO數字+”表示質量等級。“數字+”表示該瓶蜂蜜中MGO含量大于“數字”(mg/kg),例如“MGO 100+”表示MGO含量大于100 mg/kg。數字越大,質量等級越高,價格也越昂貴[21]。麥盧卡蜂蜜中MGO含量高的原因是麥盧卡樹花蜜具有高水平的二羥基丙酮,經過脫水即形成MGO。MGO在麥盧卡蜂蜜中可達800 mg/kg[22]。麥盧卡蜂蜜質量等級評價還具有另一套體系,即unique manuka factor(UMF)。UMF并非是一種具體分子,而是包含MGO作用在內的抗菌效應總稱。UMF值以具有同樣抗菌效果的苯酚水溶液濃度表示[23],例如“UMF5+”意味著該瓶麥盧卡蜂蜜與5%苯酚水溶液的抗菌能力相當。由于2種體系均以抗菌活性為質量等級評價依據,因此它們之間存在一定的對應和換算關系。通過鐵離子還原/抗氧化能力法(ferric reducing antioxidant power,FRAP)對不同UMF等級的麥盧卡蜂蜜進行檢測,發現其FRAP值與UMF值呈強正相關(R2=0.977)[24],表明UMF值在一定程度上亦可反映麥盧卡蜂蜜的抗氧化能力。

1.4 香氣成分

麥盧卡蜂蜜屬于顏色較深的單花蜜,具有特殊香味,目前已從中鑒定出多種揮發性成分,包括芳香類、烷烴類、酯類、醇類、萜烯類、酸類、酮類、醛類和醚類分子,揮發性成分與蜂蜜香氣密切相關。在不同檢測體系中,這些成分的種類和含量具有差異。總體來說,含有苯環的丁香酸甲酯、鄰甲氧基苯乙酮、甲基苯并呋喃、2′-羥基苯乙酮和2′-甲氧基苯乙酮是主要揮發性物質[25-28],因此它們可能是麥盧卡蜂蜜風味的重要決定因素。

1.5 礦物質

麥盧卡蜂蜜中含量最高的礦物質是鈣(123.1 mg/100 g)、鉀(122.8 mg/100 g)、鈉(34.7 mg/100 g)和鎂(27.5 mg/100 g),這4種元素也是很多蜂蜜中含有的主要礦物質。在蕎麥蜂蜜(buckwheat honey)中,鈣、鈉和鎂含量分別為153.5、38.5和31.6 mg/100 g,均略高于麥盧卡蜂蜜;但鉀含量(39.1 mg/100 g)比麥盧卡蜂蜜低3倍多[29]。因此,麥盧卡蜂蜜具有較高的鉀含量,而鉀是維持機體健康不可或缺的元素[30]。

1.6 蛋白質成分

麥盧卡蜂蜜中的蛋白質成分主要包括蜂王漿主蛋白家族、糖苷酶類、氧化還原酶類、酯酶類和肽酶類等[31]。麥盧卡蜂蜜總蛋白含量并不高,為90.3 mg/100 g,低于澳大利亞藿香蜂蜜(142.8 mg/100 g)和茶樹蜂蜜(131.9 mg/100 g)[14];也有研究表明,麥盧卡蜂蜜總蛋白檢測值為63 mg/100 g,低于蕎麥蜂蜜(183 mg/100 g)[29]。就單獨蛋白質分子而言,蜂王漿主蛋白6含量低于新西蘭三葉草蜂蜜[31];阿拉伯半乳聚糖蛋白含量低于新西蘭卡努卡蜂蜜[32],這意味著蛋白質可能并非麥盧卡蜂蜜的關鍵活性成分。事實上,麥盧卡蜂蜜中高濃度的MGO能夠破壞一些酶的結構[33],這可能是其蛋白質含量較低的原因。此外,高含量的MGO導致麥盧卡蜂蜜中的美拉德反應產物與其它蜂蜜不同,典型特征是麥盧卡蜂蜜中羧乙基賴氨酸(carboxyethyllysine,CEL)和MGO衍生的氫化咪唑酮1(methylglyoxal-derived hydroimidazolone 1,MG-H1)含量很高,麥盧卡蜂蜜蛋白質中31%的賴氨酸和8%的精氨酸殘基參與了CEL和MG-H1的形成,且麥盧卡蜂蜜中MGO濃度越高,賴氨酸濃度則越低[34]。部分蛋白質參與形成美拉德反應產物,可能是導致麥盧卡蜂蜜中蛋白質含量較低的另一因素。較為特殊的美拉德反應產物,是麥盧卡蜂蜜色澤較深的原因之一,也可作為其真偽辨別的檢測指標。

綜上所述,在成分特征方面,麥盧卡蜂蜜具有較低的果糖/葡萄糖比值和蛋白質水平,以及較高含量的MGO和黃酮類/酚酸類化合物,這些特點與麥盧卡蜂蜜的促健康功能密不可分。

2 麥盧卡蜂蜜抗病原微生物機理

2.1 抗菌作用途徑

2.1.1 過氧化物途徑

蜂蜜均具有一定的抗菌活性,根據其作用機理不同,可分為過氧化物途徑和非過氧化物途徑。過氧化物途徑是蜂蜜中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶(來源于蜜蜂自身分泌物)的催化作用下,生成葡萄糖酸和H2O2,H2O2發揮抗菌功能的過程[35]。該途徑是大多數蜂蜜主要的抗菌機制,然而,對于麥盧卡蜂蜜則相反。麥盧卡蜂蜜中的MGO可破壞葡萄糖氧化酶結構,導致其活性降低,從而抑制H2O2的產生[33]。因此,過氧化物途徑可能是麥盧卡蜂蜜的次要抗菌途徑。

2.1.2 非過氧化物途徑

非過氧化物途徑可分為2類,一類是依賴于蜂蜜中的抗菌因子;另一類是基于蜂蜜自身的物理和化學性質(低pH值和高滲透壓)。麥盧卡蜂蜜中富含MGO,使其非過氧化物途徑加強,是抗菌的主要作用模式。麥盧卡蜂蜜含有高水平的酚酸類/黃酮類物質,亦有助于增強非過氧化物途徑。此外,由于麥盧卡蜂蜜中有機酸水平較高,使其具有較低的pH值(4.10)[36],低于微生物生長的最適pH值(7左右)。這些因素有利于提高麥盧卡蜂蜜抗菌效果。

2.2 抗菌作用方式

2.2.1 直接抗菌方式

通過上述2條途徑,麥盧卡蜂蜜具備改變細菌的細胞形態、抑制細胞分裂的能力。100 g/L的麥盧卡蜂蜜可干擾金黃色葡萄球菌細胞周期、影響細菌增殖,增加具有完整隔膜的細菌數量[37]。80 g/L的麥盧卡蜂蜜可完全抑制浮游態金黃色葡萄球菌生長,并且降低生物被膜形成(約95%)[38]。該現象在大腸桿菌中亦得到驗證,100和200 g/L麥盧卡蜂蜜顯著抑制其浮游態生長、降低生物被膜形成和生物被膜態細胞活力(>70%)[39]。在綠膿桿菌中,麥盧卡蜂蜜的最小抑制濃度(minimum inhibitory conentration,MIC)低至95 g/L,加入麥盧卡蜂蜜可破壞細胞結構完整性[40]。

麥盧卡蜂蜜的直接抗菌作用與其阻斷菌體分子表達有關。使用MIC(300 g/L)1/2或1/4的麥盧卡蜂蜜,即可降低病原菌關鍵致毒因子嗜鐵素的水平(下調1.3～2.2倍)[41]。120 g/L的麥盧卡蜂蜜通過調控菌落形成相關基因algD和oprF的表達水平(升高algD16倍、降低oprF10倍),阻止菌落形成,促進菌體裂解[42],亦通過抑制主要鞭毛蛋白FliC,以及與鞭毛蛋白合成相關基因(fliA、flhF、fleN、fleQ和fleR)的表達,減弱細菌運動能力[43]。此外,細菌中的脲酶可將尿素轉化為氨,有利于細菌在酸性環境生存。麥盧卡蜂蜜通過MGO抑制脲酶活性,也是其直接抗菌方式的機理之一[22]。

2.2.2 間接抗菌方式

麥盧卡蜂蜜還通過調控免疫細胞活性,發揮間接抗菌作用。MGO有助于5-A-RU轉化為5-OP-RU,后者作為抗原可快速從黏膜表面進入胸腺,被胸腺細胞捕獲,通過MHC Ib分子MR1呈遞給黏膜相關恒定T細胞(mucosal-associated invariant T cell,MAIT細胞),激活并驅動其增殖。MAIT細胞具有抗菌和維持黏膜完整性的功能[44-45]。通過激活免疫細胞,實現抗菌功能,也是麥盧卡蜂蜜抗菌功能的重要特點。

綜上所述,麥盧卡蜂蜜顯著的抗菌特性是多方面因素協同作用的結果,其通過多層次的抗菌機理發揮抗菌作用(圖1)。

圖1 麥盧卡蜂蜜主要抗菌機理Fig.1 The major mechanisms of anti-bacterial activity of Manuka honey

2.3 強化抗生素活性

2.3.1 協同或累加效應

抗生素殘留是影響食品安全和導致環境污染的重要因素之一。麥盧卡蜂蜜不僅在單獨使用時抗菌效果良好,與抗生素聯合使用時亦表現出協同或累加抗菌效應。與萬古霉素聯合使用對抗金黃色葡萄球菌,∑FBEC值(該值表示生物膜消除濃度分數,≤0.5具有協同效應;0.5～1具有累加效應)為0.34;與慶大霉素聯合使用對抗綠膿桿菌,∑FBEC值為0.78～0.82[46],表明麥盧卡蜂蜜作為天然、綠色食品,可部分替代和減少抗生素的使用。

2.3.2 降低耐藥性

當前抗生素的普遍使用促使細菌產生耐藥性,繼而在抗菌過程中效果不佳。值得注意的是,麥盧卡蜂蜜能夠抑制耐藥菌,例如在抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌株MRSA中加入麥盧卡蜂蜜,可使普遍脅迫蛋白A的表達水平下調16倍,從而降低細菌耐藥性,達到抑菌目的[47],這一發現為利用天然產物解決細菌耐藥性問題提供了新思路。

2.4 增益腸道菌群

腸道菌群是人體消化道內細菌總和,其數量多于人體細胞,并且與機體健康密切相關[48]。麥盧卡蜂蜜的抗菌功能具有選擇性,用麥盧卡蜂蜜連續飼喂小鼠[2.2 g/(kg·d)]28 d,并不影響腸道內擬桿菌和雙歧桿菌等益生菌的生長,僅略微影響有機酸代謝產物(甲酸升高、琥珀酸降低)[49]。在利用羅伊氏乳桿菌生產的酸奶中添加麥盧卡蜂蜜(50 g/L)會產生更優的發酵產物,尤其是乳酸和丙酸,并且顯著增加益生菌數量,改善口感、表觀黏度和持水力。因此,麥盧卡蜂蜜可應用于合生素制劑,維持腸道菌群健康[50]。

2.5 抗病毒機理

2.5.1 抑制病毒復制

病毒依賴宿主細胞進行自我復制,可導致宿主細胞形態、功能改變,甚至死亡。不少抗病毒藥物作用機理就是靶向抑制病毒復制。根據基因組性質不同,病毒可分為RNA病毒和DNA病毒。麥盧卡蜂蜜可有效抑制2類病毒的復制。例如,正粘病毒科的流感病毒屬于RNA病毒,加入麥盧卡蜂蜜后,其在腎細胞中的復制能力顯著降低(半數最大抑制濃度half-maximal inhibitory concentration,IC50=3.6 g/L)。對比發現,麥盧卡蜂蜜抑制流感病毒復制能力優于其他蜂蜜(蕎麥蜂蜜、刺槐蜂蜜和紫云英蜂蜜等)。抗流感病毒藥物扎那米韋和奧司他韋與麥盧卡蜂蜜聯合使用,兩者IC50值可降低至1/1 000左右[51],亦表明麥盧卡蜂蜜可作為抗流感藥物輔助成分。皰疹病毒科的水痘帶狀皰疹病毒是DNA病毒,在黑色素瘤細胞中的復制亦可被麥盧卡蜂蜜抑制,半數最大效應濃度EC50約為45 g/L,略低于三葉草蜂蜜[52],體現了麥盧卡蜂蜜抗病毒復制的潛力。

2.5.2 抑制逆轉錄酶活性

病毒中有一大類屬于逆轉錄病毒(例如艾滋病病毒),其基因組RNA經過逆轉錄酶合成雙鏈DNA,再整合到宿主細胞染色體DNA,隨宿主細胞分裂而復制。麥盧卡蜂蜜顯著抑制艾滋病病毒HIV-1逆轉錄酶活性,IC50為14.8 g/L,抑制效果強于刺槐蜂蜜、迷迭香蜂蜜和紫云英蜂蜜。麥盧卡蜂蜜中的MGO和2-甲氧基苯甲酸被認為是主要作用分子,HIV-1逆轉錄酶活性隨這2種分子濃度升高而降低,呈濃度依賴性[53],未來可通過分子模擬等手段進一步證實它們之間存在互作關系。

2.6 抗真菌和寄生蟲

除抗菌和抗病毒外,麥盧卡蜂蜜具有一定的抗真菌和抗寄生蟲活性,40%、60%和80%(體積分數)的麥盧卡蜂蜜均可完全抑制外瓶霉(12 h)和鐮刀霉(6 h)生長[54]。另有研究顯示,二星瓢蟲感染微孢子蟲后發育時間從13.0 d延長至16.3 d,而補飼麥盧卡蜂蜜(5%,10%,15%)后, 發育時間縮短至15.0、15.2、15.6 d,孢子數量也從19.4/120 μm2降至19.0/120、19.1/120、14.3/120 μm2[55]。麥盧卡蜂蜜抗藍氏賈第蟲和陰道毛滴蟲的IC50分別為5.6%和1.5%(體積分數)[56]。目前關于麥盧卡蜂蜜抗真菌和抗寄生蟲研究不多,但可能和抗菌、抗病毒存在相似機制。

3 麥盧卡蜂蜜調節炎癥模式

3.1 調控炎性細胞活性

3.1.1 調控炎癥因子水平

麥盧卡蜂蜜具有調控炎癥因子分泌的作用。在沒有刺激物的情況下,10 g/L的麥盧卡蜂蜜促進巨噬細胞(RAW 264.7)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的基因表達升高26倍,分泌量升高27倍;其他促炎因子,包括白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)亦呈升高趨勢[57],麥盧卡蜂蜜表現促炎效應;而在模擬炎性條件下,即巨噬細胞受到脂多糖(1 mg/L)刺激時,TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS表達水平升高的趨勢被麥盧卡蜂蜜(8 g/L)抑制[58],麥盧卡蜂蜜表現抗炎效應。

在中性粒細胞(dHL-60)中,加入脂多糖、脂多糖+趨化肽fMLP,或脂多糖+fMLP+干擾素-γ+粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子模擬炎性條件,加入低濃度麥盧卡蜂蜜(0.5%,體積分數),可下調TNF-α、IL-1β、巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、MIP-1β、IL-12 p70、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)、MMP-1、成纖維細胞生長因子-13、IL-1ra和IL-4水平,上調MIP-3α、蛋白酶3、血管內皮生長因子和IL-8水平;但加入高濃度麥盧卡蜂蜜(3%,體積分數),則上調TNF-α,而下調其他分子水平[59],表現出濃度差異性。中性粒細胞內部含有大量顆粒物。以脂多糖+fMLP刺激中性粒細胞,使其釋放過氧化物能力增強,當加入麥盧卡蜂蜜(1%,體積分數),則抑制過氧化物的釋放[60],表現出抗炎效應。

3.1.2 調控趨化

趨化因子參與炎性細胞募集,是調節炎癥反應的重要分子。在巨噬細胞中,10 g/L的麥盧卡蜂蜜可提升趨化因子CXCL2和CCL2水平[57]。將抗炎因子(轉化生長因子-β、IL-4或IL-4+IL-13)加入中性粒細胞模擬抗炎條件,0.5%(體積分數)麥盧卡蜂蜜提高CXCL8/IL-8、CCL2/單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、CCL4/MIP-1β和CCL20/MIP-3α的水平;而在3%(體積分數)時,僅提高CXCL8/IL-8的水平[61],同樣體現麥盧卡蜂蜜作用的濃度差異性。另外,0.5%和3%(體積分數)麥盧卡蜂蜜可降低fMLP對中性粒細胞的趨化作用[60],表明麥盧卡蜂蜜對趨化功能的調控具有細胞特異性。

3.1.3 調控炎癥相關通路

麥盧卡蜂蜜主要通過核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)通路和Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)通路參與調控炎癥。在脂多糖+fMLP刺激下,0.5%和3%(體積分數)的麥盧卡蜂蜜可降低中性粒細胞中NF-κB抑制蛋白IκBα的磷酸化(其磷酸化可解除對NF-κB的抑制),從而負向調控NF-κB通路,抑制中性粒細胞聚集和炎性反應[60]。細胞損傷或應激時,釋放到細胞外的損傷相關模式分子可識別TLRs,激活慢性炎癥。麥盧卡蜂蜜可調控人胚胎腎細胞中的TLR1/TLR2信號通路,參與調控的分子可能是其中的多酚類物質(多酚類含量越高,作用越明顯)[62]。有研究者從麥盧卡蜂蜜中分離出一種5.8 kDa化合物,可在單核細胞中通過TLR4激活TNF-α[63]。脂多糖刺激巨噬細胞時,NF-κB/TLR4升高的趨勢亦可被麥盧卡蜂蜜抑制[58]。

綜上,麥盧卡蜂蜜對炎性細胞活性的調控具有濃度依賴性和雙向性。麥盧卡蜂蜜對炎癥反應以精細的網絡形式進行調控,這可能與其中含有的活性物質種類較多有關,并且在參與炎癥反應的不同細胞和炎癥反應的不同階段,麥盧卡蜂蜜發揮的調控作用存在差異。

3.2 調控氧化應激

3.2.1 清除自由基

細胞在內源性和外源性因素刺激下產生氧化應激,改變炎癥相關通路基因表達,這也是誘導慢性炎癥發生的關鍵因素[64]。自由基是一類帶有不成對電子的原子或基團,具有很強的氧化性,是造成細胞和組織氧化應激/損傷、導致多種疾病的“元兇”。麥盧卡蜂蜜具有直接清除自由基(·OH、DPPH自由基等)的能力。在清除DPPH自由基的對比試驗中,麥盧卡蜂蜜清除能力最強,其IC50=4.71 g/L,明顯低于馬來西亞土朗蜂蜜(IC50=8.60 g/L)和婆羅洲熱帶蜂蜜(IC50=17.51 g/L)[65]等其他類型蜂蜜。

3.2.2 調控抗氧化酶活性

抗氧化酶是體內清除自由基的一類重要分子。麥盧卡蜂蜜通過選擇性提高抗氧化酶活性抵御氧化應激。中年大鼠灌服麥盧卡蜂蜜(2.5 g/kg /d)30 d,體內氧化應激水平降低,紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性增強,而過氧化氫酶(catalase,CAT)活性減弱[66],提示麥盧卡蜂蜜選擇性地調控抗氧化酶活性。

3和8 g/L的麥盧卡蜂蜜可顯著增強巨噬細胞谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase,GST)的活性;8 g/L可顯著增強CAT活性。在病理條件下,麥盧卡蜂蜜還可以激活部分正常狀態下無法激活的抗氧化酶活性。例如在巨噬細胞中,僅加入麥盧卡蜂蜜(3和8 g/L)不影響谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)的活性,但在脂多糖誘導的氧化應激狀態下,麥盧卡蜂蜜可使GR活性顯著提高[58]。

3.2.3 調控氧化應激相關信號通路

Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1-核因子E2相關因子2(KEAP1-NRF2)通路是機體內主要的抗氧化信號通路之一。8 g/L濃度的麥盧卡蜂蜜可顯著提高KEAP1和NRF2的表達水平[58],從而激活KEAP1-NRF2通路,參與細胞抗氧化過程。

麥盧卡蜂蜜通過以上機制調控氧化應激,從而達到明顯的抗炎效果。巨噬細胞中加入脂多糖,可誘導活性氧簇(含氧原子的自由基)增多,造成脂類、蛋白質和DNA損傷,而麥盧卡蜂蜜可在一定程度上改善此類狀況[58]。在三硝基苯磺酸誘導的大鼠結腸炎模型中,口服麥盧卡蜂蜜(5和10 g/kg),顯著減少氧化應激和脂質過氧化(脂質過氧化即氧化應激導致的脂類成分破壞),減輕結腸炎癥狀[67]。

由于具備調控炎性細胞活性和氧化應激能力(如圖2所示),麥盧卡蜂蜜的抗炎功能在臨床數據中得到證實。它可緩解與囊性纖維化相關的慢性鼻竇炎,與生理鹽水相比,滴注10%(體積分數)濃度的麥盧卡蜂蜜顯著改善癥狀[68]。在對牙周炎進行非手術牙周治療過程中,使用麥盧卡蜂蜜可顯著改善牙周探診深度和臨床附連度指標,說明麥盧卡蜂蜜可輔助治療牙周炎[69]。

圖2 麥盧卡蜂蜜調節炎癥模式Fig.2 The modes of inflammatory regulation of Manuka honey

在腫瘤細胞中,麥盧卡蜂蜜反而激活氧化應激以對抗腫瘤細胞活性(在第5部分有詳細描述),具有細胞特異性和選擇性是麥盧卡蜂蜜生物學活性特點之一。

4 麥盧卡蜂蜜抗損傷效應

4.1 促傷口愈合

傷口愈合過程與細菌和炎癥關系密切。在組織受損、出現傷口時,往往伴隨細菌感染,細菌能以生物被膜態存在,生長較慢,躲避抗生素作用幾率較大,使傷口愈合延遲[70]。由于麥盧卡蜂蜜具有抑制細菌生物被膜態和耐藥性的作用,以及調節炎癥反應的能力,因此可有效促進傷口愈合。在馬機械性皮膚損傷模型中,66%麥盧卡蜂蜜可減輕傷口炎癥,增強血管生成、纖維化、膠原蛋白合成和上皮細胞增生[71]。在兔燒傷模型中,未經藥物處理的傷口愈合時間為36 d,使用1%呋喃西林(常用燒傷藥)軟膏縮短至32 d,使用1%麥盧卡蜂蜜軟膏縮短至31.33 d,而呋喃西林+麥盧卡蜂蜜聯合使用,愈合時間縮短至27 d,說明麥盧卡蜂蜜可有效促進燒傷傷口愈合[72]。臨床數據表明,麥盧卡蜂蜜聯合抗生素作為敷料,可使平均深度為5.72 mm的傷口在4周后降至0.88 mm,提示麥盧卡蜂蜜能夠促進組織修復、抑制炎癥反應,加快自溶清創[73]。

4.2 抑制潰瘍

潰瘍指黏膜或皮膚出現潰爛或缺失,是一種特殊形式的慢性創傷。在乙醇誘導的胃潰瘍大鼠模型中,攝入麥盧卡蜂蜜(2.5 g/kg)可顯著升高胃黏膜NO、GSH、SOD和CAT等抗氧化應激分子水平,降低血漿TNF-α,IL-1β和IL-6等促炎因子水平[74]。在乙酸誘導的大鼠胃潰瘍模型中,給予麥盧卡蜂蜜(2.5 g/kg)具有相似效果。麥盧卡蜂蜜能夠降低黏膜髓過氧化物酶活性、脂質過氧化水平和促炎性細胞因子(TNF-α,IL-1β和 IL-6)水平,同時升高抗氧化物質(SOD、GPx和GSH)和抗炎性細胞因子(IL-10)水平[75]。

糖尿病足是一種嚴重的糖尿病慢性并發癥,其臨床癥狀包括潰瘍、感染和疼痛[76]。使用麥盧卡蜂蜜敷料,潰瘍平均愈合時間為31 d, 而使用普通敷料的平均愈合時間為43 d,并且使用麥盧卡蜂蜜敷料患者未感染比例也高于使用普通敷料患者(在使用第1周,兩組比例分別為78.13%和35.5%,隨后幾周同樣趨勢)[77]。麥盧卡蜂蜜對陰莖潰爛癥狀也具有顯著的改善作用[78]。以上數據表明,麥盧卡蜂蜜可作為加速傷口愈合(包括潰瘍在內)的敷料。

4.3 抗血管凍傷與痙攣

與一般組織損傷不同,凍傷是低溫導致的局部缺血性血管損傷,并且普通抗損傷藥物對其很難有效,血栓引起的缺血是造成與其相關組織壞死的主要原因。在大鼠凍傷模型中,使用麥盧卡蜂蜜可使傷口在18 d內恢復,其機制可能是其中的leptosin及其他植物性成分具有的抗血栓性質[79]。

血管痙攣是動脈血管異常收縮,影響機體血液流量和流速[80],因此可能導致機體缺氧。在股動脈痙攣大鼠模型中,使用0.1 mL麥盧卡蜂蜜可顯著降低血管壁厚度、增大管腔直徑,緩解痙攣,這可能與麥盧卡蜂蜜抗氧化和抗炎功能密切相關[81]。

5 麥盧卡蜂蜜抗腫瘤機制

5.1 激活凋亡因子

抗腫瘤的關鍵是促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖。目前研究證實,麥盧卡蜂蜜可促進多種腫瘤細胞凋亡。麥盧卡蜂蜜(體積分數為5%)可激活黑色素瘤細胞(B16.F1)的促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3、-9(Caspase-3、-9),抑制抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2);通過靜脈注射麥盧卡蜂蜜(500 g/L,100 μL)可抑制33%的小鼠黑色素瘤[82]。

麥盧卡蜂蜜(20和50 g/L)可分別激活結腸癌細胞HCT-116和LoVo中Caspase-3、-8、-9,以及cleaved-聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]和p53,抑制細胞增殖,引發細胞周期阻滯,促進細胞凋亡,這可能與麥盧卡蜂蜜在腫瘤細胞中激活氧化損傷、改變線粒體呼吸和糖異生,以及減弱轉移能力直接相關[83-84]。麥盧卡蜂蜜(或者與5-氟脲嘧啶聯合使用)可減少結腸腺癌細胞來源的結腸球體(含有大量癌干細胞樣細胞)質量、直徑和密度,阻礙癌干細胞樣細胞生存能力[85]。麥盧卡蜂蜜與5-氟脲嘧啶能夠發揮協同抗腫瘤效應,提高化療效果。該作用機制主要體現在上調促凋亡因子Bax、Caspase-3、-8、-9和cleaved-PARP,抑制結腸癌細胞增殖和遷移(下調表皮生長因子受體、磷酸化蛋白激酶p-Akt和磷酸化雷帕霉素靶蛋白p-mTOR等促增殖蛋白表達;下調MMP-2、-9并升高N、E-鈣粘蛋白表達),并且通過下調SOD、CAT、GPx和GR等抗氧化酶水平,增強氧化損傷[86]。

麥盧卡蜂蜜同樣抑制肝癌細胞HepG2(p53非突變型)和HepB3(p53突變型)的增殖,IC50濃度分別為6.92%和18.62%。尤其對于HepG2細胞株,麥盧卡蜂蜜處理48 h即可觀察到明顯的凋亡形態;與阿霉素聯合使用,通過提高Bax、降低Bcl-2和促增殖蛋白[磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、細胞周期蛋白Cyclin D1和mTOR],以及原癌蛋白(β-連環蛋白)水平,增強其誘導凋亡能力[87], 進一步證明了麥盧卡蜂蜜可激活腫瘤細胞凋亡因子,促進腫瘤細胞凋亡。

5.2 抑制IL-6/STAT3信號通路

IL-6是一種促腫瘤細胞因子,與IL-6受體IL-6R結合后,啟動IL-6R作為信號轉導的β鏈糖蛋白130(glycoprotein 130,gp130),激活Janus激酶(Janus kinases,JAKs),活化后的JAKs靠近信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3),使其第705位酪氨酸發生磷酸化(pY-STAT3),在細胞核與相應的靶基因啟動子結合,調控靶基因的表達[88],從而參與腫瘤的生長和轉移。p-STAT3作為原癌性轉錄因子,參與約50%乳腺癌和肺癌的發生。麥盧卡蜂蜜(10 g/L)能夠迅速減弱乳腺癌細胞(MDA-MB-231和MCF-7)中pY-STAT3(>80%)和IL-6的水平,抑制細胞增殖、促進細胞凋亡,提示IL-6/STAT3信號通路可能是麥盧卡蜂蜜抗乳腺癌的早期作用靶點[89]。在肺癌細胞中,麥盧卡蜂蜜亦可顯著抑制p-STAT3,以及gp130和p-JAK2水平,后兩者正是IL-6R信號通路的上游分子。麥盧卡蜂蜜可特異性地與IL-6Rα結合(而不與IL-11Rα和 IL-8R結合),導致IL-6Rα與IL-6結合的幾率降低約60%。在此過程中起關鍵作用的是黃酮類物質,包括木犀草素、槲皮素、高良姜素和白楊素。它們均可與IL-6Rα產生互作,從而影響IL-6功能,抑制癌癥[90]。

由此可見,麥盧卡蜂蜜抗腫瘤的作用機制主要包括:激活促凋亡因子、抑制抗凋亡因子、增強腫瘤細胞氧化損傷、阻滯腫瘤細胞周期,降低腫瘤細胞增殖和遷移(圖3)。此類機制只發生在腫瘤細胞中,對非腫瘤細胞無影響[83-84]。事實上,許多抗癌藥物(尤其是天然產物)也有此特點。這可能與腫瘤細胞和非腫瘤細胞的表面標志以及信號轉導通路存在差異有關。然而,麥盧卡蜂蜜為何具有明顯的細胞特異性和選擇性仍不清楚,有待進一步研究。

圖3 麥盧卡蜂蜜抗腫瘤機制Fig.3 The anti-tumor mechanisms of Manuka honey

6 影響神經系統功能

6.1 抗神經退行性疾病

阿爾茨海默癥是一種以記憶、認知和行動能力下降為特征的神經退行性疾病,一般認為是腦內β-淀粉樣蛋白聚集形成老年斑,以及微管相關蛋白Tau高度磷酸化形成神經原纖維纏結[91]。在基于秀麗隱桿線蟲(CL4176)的阿爾茨海默癥模型中,麥盧卡蜂蜜可通過調控熱休克蛋白HSP-16.2和轉錄因子SKN-1/NRF2通路,減少氧化應激,延緩β-淀粉樣蛋白誘導的行動麻痹,從而具有抗阿爾茨海默癥的潛力[92]。

6.2 減輕疼痛

“痛”是炎癥的主要臨床癥狀之一。癌癥化療易引起口腔黏膜炎,發病率約40%～80%,并伴隨疼痛。麥盧卡蜂蜜能夠顯著降低接受白血病化療兒童的炎癥程度;通過面部視覺模擬評分法(visual analogue scale,VAS)評估疼痛程度,VAS評分顯著下降,表明麥盧卡蜂蜜可有效緩解化療引發的、與口腔黏膜炎相關的疼痛[93]。

除了緩解炎癥引起的疼痛,麥盧卡蜂蜜還可減輕機械性原因導致的疼痛。人類第三磨牙是最晚萌出的牙齒,但由于此時沒有足夠空間供其生長,故而容易形成“智齒”阻生或錯位萌出,往往需要人工拔除,傷及下牙槽神經或舌神經,造成疼痛[94]。在拔除第三磨牙手術后隨即灌注麥盧卡蜂蜜,術后第1、2 天VAS評分顯著低于未經麥盧卡蜂蜜處理患者[95]。

7 小結與展望

通過細胞、動物和臨床試驗,闡明了麥盧卡蜂蜜具有一系列促健康功能。這不僅為人們合理消費和利用麥盧卡蜂蜜提供了理論依據,而且也為我國蜂蜜產業的科學發展提供了很好的思路。據美國國家生物技術信息中心PubMed數據庫顯示,關于麥盧卡蜂蜜的研究從1991年就已開始,目前仍在進行,不斷有新的研究成果,并且數量逐年上升。我國不少具有地方特色、獲得國家地理標志的蜂蜜,其促健康功能的研究數量還較少,由于缺乏科技支撐,限制了我國蜂蜜高附加值的開發和利用。因此,我國蜂蜜產業亟需加強科研投入,對其特性和功能進行深入闡釋,為人類健康提供更科學的依據,同時也推動蜂業的健康發展。

致謝:感謝中國農業科學院蜜蜂研究所李建科教授為本文潤色語言。