響應面法優(yōu)化新疆紙皮核桃分心木中總黃酮提取工藝

周煜凡，馮疆濤，白冰瑤

1.阿克蘇地區(qū)疾病預防控制中心（阿克蘇 843000）；2.塔里木大學食品科學與工程學院（阿拉爾 843300）

核桃分心木（Diaphragma juglandisFructus）又稱核桃夾，是果核內的木質隔膜。新疆少數民族醫(yī)學記載，分心木可改善體寒、腎虛的生理虛弱，在臨床上主要用于治療遺精滑泄、尿頻遺尿、崩漏、帶下、泄瀉、痢疾[1]。現代研究發(fā)現，核桃分心木中富含黃酮、多酚、多糖、皂苷、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸及微量元素等營養(yǎng)成分[2-3]，具有良好的藥理作用。

紙皮核桃因皮薄如紙、易取整仁而得名，又名露仁核桃，在我國主要產地分布在新疆和云南，又以新疆阿克蘇的產品為佳。紙皮核桃中含有豐富的蛋白質、鈣、磷、鐵等礦物質和微量元素及維生素[4]，具有極高的營養(yǎng)價值和經濟價值，在脫貧攻堅及鄉(xiāng)村振興中具有重要地位。當前，新疆紙皮核桃分心木多以丟棄為主，利用率極低，造成生物資源的極大浪費和一定程度的環(huán)境破壞，因此，通過化學方法建立分心木黃酮提取工藝是解決資源浪費的重要手段之一?？蒲泄ぷ髡邔颂曳中哪局懈鞣N具有藥用價值物質提取研究較多[5-9]，但對于新疆紙皮核桃分心木報道較少，因此，采用新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取分心木中的總黃酮，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化提取工藝，為深入開發(fā)紙皮核桃分心木提供研究基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

新疆紙皮核桃（購自阿克蘇市三角地農貿市場），將核桃分心木清洗后放置在陰涼處充分干燥，干脆后粉碎，過0.250 mm（60目）篩，置于保鮮袋中妥善保存；蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純）。

GX-20多功能粉碎機（浙江高鑫工貿有限公司）；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器（金華市醫(yī)療儀器廠）；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；QENE單道移液器（上海寶予德科學儀器有限公司）；LE204E萬分之一天平（梅特勒托利多集團）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DHG-9203A電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線繪制

參考文獻[10]方法，將蘆丁標準品充分干燥后精確稱取10.0 mg蘆丁標準品，用體積分數30%的乙醇溶液將稱取的蘆丁標準品定容在100 mL容量瓶中，搖勻后作為0.1 mg/mL蘆丁標準溶液，備用。將配制好的蘆丁標準品溶液作為母液，在10 mL容量瓶中按梯度精準配制質量濃度為0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的蘆丁標準品溶液，在不同濃度的蘆丁標準品溶液中分別加入0.3 mL 5%（質量分數）的NaNO2溶液和10% Al(NO3)3，混合均勻后靜置6 min，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用體積分數30%的乙醇溶液定容。靜置15 min，待定容好的溶液充分混合均勻，在510 nm波長下測定樣品的吸光度，平行測定3次。

可根據紫外-可見分光光度法測得各濃度蘆丁標準溶液（X）對應的吸光度（Y），對結果進行擬合，得到回歸方程Y=11.779X+0.067 6，R2=0.999 4。結果表明在0～0.06 mg/mL范圍內，蘆丁標準液濃度與吸光度之間具有良好線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.2 總黃酮提取工藝

采用熱回流法提取分心木中的黃酮，稱取1 g核桃分心木粉末置于圓底燒瓶，用一定料液比加入一定體積分數乙醇溶液，冷凝回流，在一定溫度下以1 000 r/min磁力攪拌一段時間，待回流結束后將圓底燒瓶中的混合溶液倒出并抽濾，得黃酮粗提液。以30%乙醇將收集的粗提液定容至100 mL，備用，參照標準曲線測定方案，測定分心木黃酮粗提液的吸光度，平行測定3次，代入標準曲線方程計算黃酮濃度，按式（1）計算黃酮提取率。

式中：Y為黃酮提取率，%；C為黃酮質量濃度，g/mL；V為黃酮提取液體積，mL；m為紙皮核桃分心木質量，g。

1.2.3 單因素試驗

選取乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度進行單因素試驗，分別考察4個不同因素對黃酮吸光度的影響，單因素試驗設計表見表1。

表1 單因素試驗設計

1.2.4 紙皮核桃總黃酮提取工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 12.0.3.0軟件，在單因素試驗基礎上，分別將乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度4個影響因素組合，形成四因素三水平響應面試驗，以總黃酮提取率為響應值進行Box-Behnken試驗設計，因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計

1.3 數據統(tǒng)計

試驗所有數據測定3次，取平均值+標準偏差值；繪圖采用Origin 2019b軟件；響應面分析軟件為Design-Expert 12.0.3.0；采用IBM SPSS Statistics 26進行顯著性分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同乙醇體積分數對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

考察了乙醇體積分數對紙皮核桃分心木總黃酮提取的影響。對不同乙醇的體積分數（30%，40%。50%，60%和70%）進行單因素試驗。試驗結果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，乙醇體積分數開始增大時，吸光度增加，乙醇體積分數60%時總黃酮提取率為3.83%，達到最大，但乙醇體積分數繼續(xù)增加，黃酮提取率降低?？赡艿脑蚴且掖俭w積分數較低時，溶液極性較大，提取物溶出的雜質較多，黃酮得率較低[11]，濃度增大時，極性開始減小，分心木中黃酮的極性與此體積分數乙醇極性接近，提取率增大，但隨著乙醇體積分數繼續(xù)增加，醇溶性的雜質開始增多，而黃酮的溶出量減少[12]。由此得出乙醇體積分數60%較為適宜。

2.1.2 不同料液比對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑的用量會對總黃酮的提取率產生影響。考察了不同料液比（1︰20，1︰30，1︰40，1︰50和1︰60 g/mL）對核桃分心木總黃酮的提取率的影響，試驗結果如圖3所示。

圖3 料液比對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，料液比從1︰20（g/mL）變化至1︰40（g/mL）時，總黃酮提取率從2.75%增大至3.83%，繼續(xù)增加料液中液體占比，總黃酮提取率呈降低趨勢，1︰60（g/mL）時，總黃酮提取率3.04%。主要是由于溶劑對分心木中的黃酮具有溶解和擴散作用，溶劑用量增大時，黃酮溶解得越多，提取率越高[13]，隨著溶劑體積繼續(xù)增大，黃酮溶解基本達到飽和，但醇溶性雜質的溶解也逐漸增多[14]，黃酮提取率隨之降低，因此，料液比選擇1︰40（g/mL）。

2.1.3 不同提取時間對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑萃取法提取總黃酮中，提取時間也會有重要影響。將核桃分心木分別浸泡1，2，3，4和5 h，試驗結果如圖4所示。

圖4 提取時間對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增長，總黃酮提取率顯著增加，提取時間達到3 h時，總黃酮提取率達到最大，提取時間超出3 h時，提取率呈降低趨勢?？赡艿脑蚴请S著時間的延長，紙皮核桃分心木中的雜質析出增多，黃酮提取率降低[15]。因此，提取時間選擇3 h。

2.1.4 不同提取溫度對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溫度的升高有利于溶劑分子熱運動，加快反應速率。在核桃分心木提取總黃酮中，分別考察提取溫度為40，50，60，70和80 ℃時的總黃酮提取率，試驗結果如圖5所示。

圖5 提取溫度對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大，提取溫度70 ℃時為最大，提取溫度大于70 ℃時，提取率卻隨之降低?？赡艿脑蚴请S著提取溫度的升高，小分子運動加快，有利于紙皮核桃分心木黃酮的溶出[16]，但溫度繼續(xù)增加，有可能導致部分黃酮的結構受到破壞[17]，此外，高溫下乙醇揮發(fā)，濃度降低也會導致黃酮提取率下降[18]。因此選擇提取溫度為70 ℃。

2.2 響應面法優(yōu)化分心木總黃酮提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，以總黃酮提取率為指標，采用響應面Box-Behnken Design試驗設計，試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

根據表3所示的試驗數據，運用Design-Expert 12.0.3.0軟件進行回歸分析，得到回歸方程Y=3.86+0.149 2A+0.133 3B+0.717 5C+0.1D-0.18AB-0.172 5AC+0.21AD+0.157 5BC-0.322 5BD+0.057 5CD-0.276 2A2-0.262 5B2-0.323 8C2-0.387 5D2。

2.2.2 方差分析

從方差分析可以看出模型的P值小于0.000 1，響應面回歸模型為極顯著水平，具有統(tǒng)計學意義，失擬項的P值大于0.05，影響不顯著，試驗模型擬合良好，說明各因素選擇合理。從表4可以看出，交互項BD，二次項A2，B2的P值小于0.05，說明對紙皮核桃分心木總黃酮提取影響顯著，一次項C，二次項C2，D2的P值小于0.01，說明對總黃酮提取影響極顯著，其他因素不顯著。根據F值和P值可以得到各因素影響分心木總黃酮提取率的順序：提取時間＞乙醇體積分數＞料液比＞提取溫度。

表4 方差分析

模型的多元相關系數R2=0.914 7，說明所構建的模型相關性較好；Radj2=0.829 4，Rpred2=0.683 3，Radj2-Rpred2＜0.2，回歸模型能充分說明工藝過程；C.V.為7.50%（＜10%），表明試驗的可信度和精確度較高；精密度為11.438 4（＞4），用此模型預測紙皮核桃分心木中總黃酮提取率合適[19-21]。

2.2.3 交互作用分析

為考察各個因素交互作用對總黃酮提取率的影響，根據二次方程分別作出任意2個試驗因素間交互作用三維響應面圖和等高線圖。

等高線和響應曲面圖能直觀反映交互作用對響應值的影響程度，等高線越密集，曲面越陡，則交互作用的影響越顯著，且等高線越接近橢圓，2個因素的交互作用越強[22-23]。從圖6可以看出，料液比和提取溫度的交互作用最強，乙醇體積分數和提取溫度交互作用次之，對應的響應面圖坡度陡峭，與方差分析中的結論一致。

圖6 各因素交互作用對總黃酮提取率影響的等高線及響應面圖

2.2.4 驗證試驗

根據Design-Expert 12.0.3.0預測結果可得：乙醇體積分數56.110%、料液比1︰43.334（g/mL）、提取時間3.631 h、提取溫度69.312 ℃時，總黃酮提取率為4.200%。參照預測得到的最優(yōu)試驗條件，同時為驗證試驗易于操作，將各條件修正為乙醇體積分數56%、料液比1︰43（g/mL）、提取時間3.6 h、提取溫度69℃，此時紙皮核桃分心木總黃酮提取率為4.131%±0.045%（n=3），預測值與實際值之間相差1.64%，結果吻合度高，說明該模型的可靠性良好，工藝具有良好的穩(wěn)定性和可行性。

3 結論

以新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取總黃酮，可以發(fā)現紙皮核桃分心木總黃酮的提取率與乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度有直接關系，并且運用單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化紙皮核桃分心木總黃酮提取工藝，得到總黃酮提取的最佳條件：乙醇體積分數56%，料液比1︰43（g/mL）、提取時間3.6 h、提取溫度69 ℃，黃酮提取率為4.131%±0.045%。該方法簡單易行，產率較可觀，適用于新疆紙皮核桃分心木中黃酮的提取。