響應面法優化構樹葉多糖堿提工藝

張曉娜，趙曼，豐亞敏，周海旭

1.新鄉工程學院（新鄉 453003）；2.河南科技學院（新鄉 453003）

構樹（Paper mulberry，Broussonetia papyrifera）也稱楮樹，為?？茦嫎鋵俣嗄晟熑~落葉喬木，廣泛分布于我國黃河、長江流域[1]。構樹病蟲害少，在自然環境中的抗逆性強，生長迅速，成活率高[2]。構樹葉中維生素、蛋白質、黃酮類、多糖等成分含量豐富[3]，有研究表明構樹葉所含的多糖具有預防腫瘤、抗溶血活性、增強免疫力和保護肝臟等重要的生理功能[4-6]。

構樹葉主要作為飼料喂養家畜[7]，從構樹葉中提取黃酮的研究較多，關于構樹葉多糖提取的研究較少，多糖的主要提取方法有水提醇沉法、加熱回流提取法和酵母發酵法[8-10]，多糖得率較低，原因可能是多糖與構樹葉中的木質素等成分存在共價酯鍵，多糖較難溶出。在堿性條件下，多糖和木質素等形成的共價酯鍵容易被破壞，可以增加多糖的溶出量[11]，因此，通常使用堿液來提取麩皮、米糠和葉子中的多糖[12]。選用NaOH溶液提取構樹葉中的多糖，并采用響應面分析法對構樹葉多糖提取工藝進行優化研究，為構樹葉綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

構樹葉（2022年11月采自新鄉市紅旗區）；濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、葡萄糖等（均為分析純）。

1.2 試驗儀器與設備

JA5003電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；H1850高速離心機（湘儀離心儀器有限公司）；FW-100高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州翔天實驗儀器廠）；723N可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；BXH-65電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 構樹葉多糖堿提工藝流程

構樹葉→洗凈烘干（105 ℃，3 h）→粉碎→稱量→配制溶液→加入NaOH溶液→水浴→離心（4 200 r/min，10 min）→取上清液→多糖含量測定

1.3.2 構樹葉多糖的測定

分別移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL 0.1 mg/mL葡萄糖標準液至20 mL比色管，用蒸餾水將比色管補至1.0 mL。分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，快速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，混勻，于30 ℃水浴反應20 min，在波長490 nm處測定吸光度。橫坐標為葡萄糖質量濃度，縱坐標為吸光度，繪制標準曲線。線性回歸方程為y=0.020 7x-0.035 3（R2=0.993 3），見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

多糖提取液經過離心，吸取上清液，稀釋一定倍數后，按照上述操作方法操作，多糖含量以質量分數（W）計，數值以百分率（%）表示，按式（1）計算。

式中：V1為樣品定容體積，mL；V2為比色測定時所移取樣品測定液體積，mL；m1從標準曲線上查得樣品測定液中的含糖量，μg；m2為樣品質量，g；n為稀釋倍數。

1.3.3 單因素試驗

在料液比1︰20 g/mL、堿提時間60 min、堿提溫度60 ℃、NaOH溶液濃度0.1 mol/L的基礎上進行單因素試驗，考察這4個因素對多糖得率的影響。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，綜合考慮，利用Box-Behnken設計原理，設計三因素三水平試驗，見表1。

表1 因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對多糖得率的影響

由圖2可知，隨著溶液量增加，多糖得率逐漸上升，這與提取液量增大溶液黏度會降低，從而使構樹葉多糖容易擴散出來有關。溶液量過大，用水量增加，廢液濃縮成本會增高。因此，綜合考慮多糖提取的整體效益，最適料液比選擇1︰30 g/mL。

圖2 料液比對多糖得率的影響

2.1.2 堿提時間對多糖得率的影響

由圖3可知，多糖得率總體上升，但隨著提取時間的變長，多糖大量溶出會導致提取液總黏度增大，由于黏度影響，剩余未溶解的多糖溶解速率會有所下降。因此，考慮到成本和提取效率，綜合最適堿提時間選擇160 min。

圖3 堿提時間對多糖得率的影響

2.1.3 堿提溫度對多糖得率的影響

由圖4可知，隨著溫度增高，構樹葉多糖得率呈現遞增趨勢，80 ℃后有所減緩。這可能是因為溫度升高后，提取液的黏度變小，分子運動會加快，構樹葉多糖更易溶出，但溫度過高會破壞多糖結構和造成其生物活性喪失[14]，所以最適提取溫度選擇80 ℃。

圖4 堿提溫度對多糖得率的影響

2.1.4 NaOH溶液濃度對多糖得率的影響

由圖5可知，NaOH溶液濃度大于0.15 mol/L時，構樹葉多糖得率增加緩慢，總體看來，NaOH溶液濃度越高，構樹葉多糖的得率也就越大，主要原因可能是NaOH溶液的存在溶解了構樹葉的細胞膜，能夠促進構樹葉多糖的釋放[13]，但提高堿液濃度會對多糖結構產生破壞，影響多糖活性，同時堿液濃度高還會造成廢液處理難度，提高生產成本。因此，NaOH溶液濃度選取0.10 mol/L。

2.2 響應面試驗

由表2可以得到二次多項回歸方程：Y=12.77+0.62A+0.62B+0.68C+0.30AB-0.28AC+0.080BC-0.56A2-0.76B2-0.27C2。

表2 響應面的試驗設計與結果

2.2.1 建立回歸方程及方差分析

由表3可知，該模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P為0.470 7，不顯著，模型與試驗值較符合。R2=0.976 5，表明模型響應值的變化97.65%來自所選變量，未知因數對試驗結果影響較小。由F值可見，各因素對多糖得率的影響順序為NaOH溶液濃度＞料液比＞堿提溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應面交互項解析

料液比、提取溫度與NaOH溶液濃度這3個單因素的相互作用對構樹葉多糖得率的影響由圖6～圖8反映。通過Design-Expert 10.0.7軟件進行響應面分析得出曲面圖存在中心點，存在最佳條件。

圖6 料液比與堿提溫度對多糖得率影響的等高線和響應曲面

由圖6可知，AB交互項等高線呈橢圓且密集，響應曲面坡面陡峭，交互作用顯著，說明料液比（A）與堿提溫度（B）的交互作用對多糖得率Y影響較大，這與回歸模型的交互項預測結果一致。

由圖7可知，AC交互項等高線接近橢圓形，曲面坡度陡峭，表明料液比（A）與NaOH溶液濃度（C）的交互作用對多糖得率Y影響顯著，但AC等高線密集程度小于AB，所以交互項AC對Y的影響小于交互項AB。

圖7 液料比與NaOH溶液濃度對多糖得率影響的等高線和響應曲面

由圖8可知，隨著堿提溫度（B）、NaOH溶液濃度（C）的增加，多糖得率均緩慢上升，這與單因素結果相同，所以堿提溫度（B）與NaOH溶液濃度（C）交互作用不顯著。

圖8 堿提溫度與NaOH溶液濃度對多糖得率影響的等高線和響應曲面

綜合分析顯示各因素對多糖得率的影響存在一定交互作用，AB、AC相互疊加影響顯著，BC不顯著，影響順序為AB＞AC＞BC。

2.2.3 驗證試驗

在Design-Expert 10.0.7軟件中對堿提構樹葉多糖的擬合進行分析，在提取160 min時，預測的該試驗最佳提取工藝為料液比1︰33.408 g/mL、堿提溫度88.483℃，NaOH溶液濃度0.117 mol/L，此時，構樹葉多糖得率的理論值為13.243%。

為檢驗所得結果的可靠性，綜合考慮成本及現有條件，按照料液比1︰33 g/mL、堿提溫度88 ℃、NaOH溶液濃度0.12 mol/L的條件，提取160 min，進行驗證試驗，同時做平行及空白試驗，多糖得率平均值為13.21%，與響應面預測值13.243%非常接近。結果表明，使用該方法優化構樹葉多糖堿提工藝的研究有良好的可行性。

3 結論

試驗利用堿液提取構樹葉多糖，采用響應面法進行優化，對多糖得率的影響順序為NaOH溶液濃度＞料液比＞堿提溫度。根據預測模型，堿提時間以160 min計，最佳提取工藝為料液比1︰33 g/mL、堿提溫度88 ℃、NaOH溶液濃度0.12 mol/L。3次驗證試驗得到的多糖平均得率為13.21%，與響應面理論值13.243%非常接近，說明響應面法對構樹葉多糖的堿提工藝條件的優化研究合理且可行。