益生元對哈士奇幼犬腸道的益生作用影響

陳茂深，劉華濤，曹永

1.江南大學未來食品科學中心（無錫 214122）；2.山東帥克寵物用品有限公司（臨沂 276300）

犬是最具有代表性的寵物，和人類相處的時間最早可追溯至公元前14 000年[1]。哈士奇是世界上最古老的犬種之一，最早人們以其作為交通工具拉雪橇，由于其獨特的外形和性格，近年來成為廣受歡迎的寵物犬。幼犬階段是犬一生中營養需求最重要的階段，選擇的犬糧成分應適合該階段犬的營養需求。幼犬糧一般易于消化吸收，營養水平較高，如幼犬吃成犬糧容易造成營養不良等問題。研究表明當日糧中的鈣和磷分別占到0.8%和0.67%時，就可以保證犬骨骼的健康成長[2]。犬糧中的纖維素對于維持犬腸道健康具有非常重要的作用，適量的纖維素水平使犬糞便成型較好。

益生元由GR.Gibson等提出，是指一種不可被消化的碳水化合物，通過選擇性的刺激一種或少數菌落中細菌的生長而對寄主產生有益的影響，進而改善宿主健康[3]。許多研究證實益生元對腸道菌群有調控作用，通常有益于雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，抑制大腸桿菌的生長[4]。國內關于益生元對犬腸道作用的研究比較少，而國外研究的方面主要是益生元對腸道菌群、氨及其他蛋白代謝產物、短鏈脂肪酸、糞便質量、營養物質消化率和免疫等的影響。但這些研究基本上都是針對于成犬，而關于益生元對幼犬的研究并不十分清楚。

依據AAFCO對生長犬營養標準的指導確定幼犬犬糧的基礎配方。在此基礎上將低聚果糖、菊粉和甘露寡糖3種益生元添加到基礎犬糧中，考察益生元的添加量對保留率的影響。采用體外模擬發酵試驗比較3種益生元對哈士奇幼犬腸道菌群、短鏈脂肪酸和發酵液pH的影響，比較其作用效果，選定合適的益生元添加到犬糧中，以期為國內生產含益生元的幼犬犬糧提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

雞胸肉（雨潤食品有限公司）；雞肉粉、豆粕、魚粉、玉米粉、米粉、微量元素、礦物質、山梨酸鉀、食鹽、磷酸氫鈣（無錫糧油市場）；大豆油（中糧集團）；低聚果糖、菊粉、甘露寡糖[量子高科（中國）生物股份有限公司]；石油醚、濃硫酸、濃硝酸、高氯酸、鹽酸、氫氧化鈉、高錳酸鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；蔗果三糖標準品、蔗果四糖標準品、蔗果五糖標準品、甘露糖標準品（sigma公司）；BBL瓊脂培養基（青島日水生物技術有限公司）；EMB瓊脂培養基（中國國藥集團上海化學試劑公司）；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品[盈芯生物科技（上海）有限公司]。

1.2 儀器與設備

FMHE72-20/40雙螺桿擠壓膨化機（湖南富馬科食品工程技術有限公司）；DFY-200搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；XMTA馬弗爐（上海實驗儀器總廠）；K1160凱氏定氮儀（蘇省宜興市科教儀器研究所）；UV-2800紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；E2695高效液相色譜儀[沃特世科技（上海）有限公司]；YJ-1340超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；DG250厭氧培養箱（英國惠特利科學有限公司）；DGG-9123A隔水式恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；MG48-PCR儀（上海谷寧儀器有限公司）；LDZH-100LS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.3 犬糧的制作

1.3.1 犬糧配方設計方法

參照美國動物飼糧管理協會AAFCO設定的關于生長犬營養成分的標準值及市售犬糧的營養標準確定粗蛋白和粗脂肪等營養物質的標準，各原料主要成分通過查閱中國食品成分表得到，原料價格由市場調查獲得，運用規劃求解的方法得出犬糧的配方。

1.3.2 顆粒犬糧加工方法

將原料粉碎過篩后混合均勻，用擠壓機進行擠壓膨化。擠壓膨化參數：五段機筒溫度分別為70，90，110，130和140 ℃，進水量20%。將膨化后的犬糧通過100 ℃的鼓風干燥機，干燥后趁熱涂油，冷卻后將犬糧密封包裝。

1.3.3 犬糧主要營養成分的測定方法

采用GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》、GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》、GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維的含量測定》、GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》、GB/T 6436—2018《飼料中鈣的測定》、GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定》和GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》測定犬糧中各營養成分。

1.4 犬糧中益生元保留率的測定

低聚果糖、菊粉和甘露寡糖3種益生元添加量均分別為0，0.25%，0.50%，0.75%和1.00%，按1.3.2的方法進行犬糧加工。將擠壓后的犬糧粉碎，根據傅博強等[5]和李仁勇等[6]的方法并稍加改動。首先對1.2～1.5 g樣品進行脫脂處理，用乙腈定容至25 mL，取1.5 mL并用0.45 μm有機濾膜過濾，所得濾液通過HPLC測定犬糧中益生元的含量。根據結果，按照式（1）計算不同添加量的益生元經擠壓后的保留率。

1.5 哈士奇幼犬糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的篩選及鑒定

1.5.1 試驗動物和飼喂條件

3只哈士奇幼犬，犬齡均為4個月，體重6 kg左右/只，犬飼喂在江南大學醫學院動物實驗中心，溫度維持在22 ℃，光照時間7：00～23：00。每只犬單獨喂養，自由飲水，飼喂時間為每天的早8點和晚8點，飼喂周期14 d。試驗期間統一飼喂不含益生元的基礎犬糧，在第14天取幼犬糞便進行試驗。

1.5.2 糞便稀釋液的制備

取2.5 g新鮮幼犬糞便于滅菌后的裝有玻璃珠的錐形瓶中，加入50 mL無菌生理鹽水搖勻，按5 000 r/min離心10 min取上清液。

1.5.3 接種培養

取1 mL糞便稀釋液加入9 mL生理鹽水中充分稀釋，依次連續稀釋至10-6。選擇2個合適的稀釋度，其中大腸桿菌選擇的是10-3和10-4，雙歧桿菌和乳酸桿菌選擇的10-5和10-6。每個稀釋度取100 μL進行平板涂布。

雙歧桿菌：BBL選擇培養基，在37 ℃下厭氧培養48 h。乳酸桿菌：LBS選擇培養基，在37 ℃下厭氧培養48 h。大腸桿菌：EMB選擇性培養基，在37 ℃下需氧培養24 h[7]。

1.5.4 菌種鑒定

挑取BBL、LBS和EMB培養基中純化3次的典型菌落進行液體培養12 h，液體培養基采用MRS肉湯+0.05%半胱氨酸鹽酸鹽。取菌液2 mL至EP管，按1 000 r/min離心2 min，棄上清得菌體。加入200 μL SDS裂解液，于80 ℃水浴30 min，加入酚-氯仿200 μL于裂解液中，顛倒混勻后按1 200 r/min離心10 min，取200 μL上清液。加入400 μL冰乙醇重懸沉淀，按1 200 r/min離心3 min，棄上清，常溫倒置30 min至2 h以上。7.50 mL ddH2O重溶沉淀以備PCR，PCR反應體系如表1所示。

表1 細菌16S rDNA 50 μL PCR反應體系

16S rDNA的PCR擴增：以提取的基因組DNA為模板，正向引物為27F：AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA 20，反向引物為1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 19，擴增片段長度為1 500 bp。PCR反應條件：預變性94 ℃，4 min；變性94 ℃，45 s，退火55 ℃，45 s，延伸72 ℃，1 min，共30個循環。由生工生物工程（上海）有限公司完成DNA的測序工作。登陸美國國家生物信息技術中心（NCBI）網站，將已知序列與所測序列對比得出結果[8]。

1.6 3種益生元體外發酵過程中腸道菌群的測定

體外模擬腸道發酵參照Olano-Martin等[9]的方法，對照組不加益生元，試驗組分別添加1%的低聚果糖、菊粉和甘露寡糖，每組設2個平行。將溶解后的培養基分裝于試管中，于115 ℃滅菌20 min，每個試管分裝9 mL，取1 mL糞便稀釋液接種于培養基中，于37 ℃厭氧發酵。

在發酵的第0，第6和第24小時取1 mL發酵液，加入9 mL生理鹽水充分稀釋，依次進行連續稀釋至10-7。取1 mL的10-5，10-6和10-73個稀釋度的稀釋液于3種培養基中培養計數。其中，6 h檢測益生元短時間的作用效果，24 h檢測益生元長時間的作用效果。

1.7 3種益生元體外發酵過程中短鏈脂肪酸的測定

將每個時間段的發酵液于常溫按12 000 r/min離心7 min，去除菌體。取上清液，過0.45 μm膜，用反相高效液相色譜法測定發酵液中的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸的濃度。

HPLC條件[10]：色譜柱為反相C18柱，流動相為0.02 mol/L KH2PO4-甲醇（98︰2，V/V），檢測波長215 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積20 μL。

1.8 3種益生元體外發酵過程中pH的測定

于第0，第6，第12，第18和第24小時取發酵液用pH計測pH。

1.9 統計分析

使用Origin Pro 8和Microsoft Excel 2019對數據進行處理、繪制和數學擬合。使用SPSS 23.0對數據進行顯著性分析，P＜0.05 時，在統計學上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 犬糧配方的建立

2.1.1 營養標準及原料的確定

犬糧配方的制作主要參照AAFCO對生長犬制定的飼養標準，如表2所示。原料的選擇方面參照市場上常用的配方原料。市售犬糧的主要原料選擇普遍采用肉類+骨粉+谷物的模式。這是因為雖然肉類是一種非常優質的蛋白原料，但實際成本偏高，而骨粉在成本上要低于鮮肉，并且蛋白含量高，二者結合既可以保證犬的營養需求，同時也考慮了經濟效益。在肉類方面大多選擇雞肉，但也有一些高端犬糧選擇采用更高品質的羊肉和牛肉。骨粉的選擇包括雞肉粉、鴨肉粉等；谷物方面主要是小麥粉、玉米粉和米粉等。最終選擇將雞肉、雞肉粉、豆粕和魚粉作為原料中的蛋白質來源。因為雞肉是一種優質的肉類原料，其蛋白含量高，約20%，并且氨基酸種類豐富，易于消化吸收。雞肉粉是將分割出胸肉之后雞的剩余部分加工而成的蛋白質飼料原料，粗蛋白含量在65%～73%，粗脂肪含量9%～10%，總體營養指標與魚粉不相上下[11]。豆粕是大豆經提取豆油后的副產品，其蛋白含量豐富，達43%，各種氨基酸含量豐富且比較平衡，特別是一些必需氨基酸的含量較高，價格較其他蛋白飼料便宜，是一種常用的飼料來源[12]。雖然豆粕中含有一些抗營養因子，但經擠壓機的高溫高壓擠壓之后可以消除這些不利因素，但添加量不宜太多，否則會影響適口性。魚粉與其他蛋白飼料相比，是一種優質的動物蛋白飼料，粗蛋白含量≥65%，具有營養成分齊全和含量均衡的優點，另外魚粉的礦物質和維生素含量也特別豐富，其中鈣和磷的含量最高，并且比例適宜，一般可達1.4︰1～2︰1[13]。谷物作為犬碳水化合物的來源，提供一定的能量和纖維素，一定量的淀粉可使犬糧更好糊化。犬糧中常用的谷物通常包括小麥、玉米和大米，由于小麥含有過敏原，可能會導致幼犬過敏，所以選擇玉米和大米作為谷物來源。纖維不能被消化，也不能提供能量，但可以加快犬消化和排便的速度，纖維過少會導致便秘，但太多也會影響腸道健康，纖維主要靠玉米皮來提供。鈣磷的補充除了靠魚粉之外，主要由磷酸氫鈣提供。礦物質和維生素用市售的預混料補充，其具體含量見表3。

表2 AAFCO營養標準（犬）

表3 預混料成分含量表（礦物質與維生素）

2.1.2 犬糧配方的制作及營養物質的測定

設計的基礎配方結果如表4所示。犬糧蛋白原料來源為雞肉、雞肉粉、魚粉和豆粕，谷物原料來源為玉米粉和米粉，纖維原料來源為玉米皮。

表4 犬糧配方及其營養物質含量 單位：%

通過查閱《中國飼料成分及營養價值表》確定各添加物的營養成分含量，并確定它們的市場價格，利用Excel規劃求解，限定各營養成分的最低標準和最高標準，以成本的最小值作為目標單元格，完成犬糧配方的最低成本優化。同時為保證犬糧的質量，將雞肉的添加量限制在不低于10%。

配方制定好后，按照配方混合原料進行擠壓，將擠壓之后的犬糧進行主要營養成分的檢測（表4）。由表4的結果可知，最終制定的犬糧主要營養成分均高于AAFCO推薦的標準。

2.2 犬糧擠壓工藝對益生元保留率的影響

在確定犬糧基礎配方后，為制造一種可以改善犬腸道健康的功能性犬糧，還需加入益生元這一功能成分。由于益生元的價格較高，考慮到成本問題，將益生元的最高添加量設定為1.00%，具體添加量分別為0.25%，0.50%，0.75%和1.00%。由于犬糧的制備過程包括物料的粉碎、擠壓膨化和干燥等過程，可能會對益生元造成損失，因此試驗探討3種益生元的添加量對保留率的影響。

在原料混合過程中，分別添加低聚果糖、菊粉和甘露寡糖粉末，添加量設計為0.25%，0.50%，0.75%和1.00%，考察3種益生元的添加量對其保留率的影響。

如圖1所示，3種益生元的保留率并不隨添加量的變化而顯著變化，說明在一定范圍內益生元的添加量對其保留率沒有顯著的影響。其中，低聚果糖的保留率都維持在較高水平，都在90%左右。菊粉和甘露寡糖的保留率比低聚果糖低，約75%。說明犬糧制粒過程中雖然這些低聚糖很穩定，但也會有些損失，其中低聚果糖的保留率最高。

圖1 益生元添加量對其保留率的影響

2.3 哈士奇幼犬糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的篩選及鑒定

試驗選擇傳統的平板計數法，使用BBL、LBS和EMB這3種選擇性培養基對糞便中3種主要腸道菌群（雙歧桿菌1、乳酸桿菌和大腸桿菌）進行篩選計數，為了對3種篩選的菌群進行進一步確定，采用分子生物學的方法鑒定其菌屬。DNA所測序列與已知序列的比對結果如表5所示。

表5 菌種鑒定結果 單位：%

結果表明，3種培養基可將雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌篩選出來，為后續試驗中利用這3種培養基進行平板計數提供條件。

2.4 3種益生元體外發酵對哈士奇幼犬腸道菌群數量的影響

在體外發酵的第0，第6和第24小時取發酵液測定其雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的菌落數。糞便發酵液的測定結果如表6所示。

表6 不同樣品體外發酵對哈士奇幼犬腸道菌群數量的影響 單位：lg CFU/mL±SD

表6反映3種益生元對哈士奇幼犬腸道菌群的不同作用效果，在發酵6 h后，試驗組與對照組相比雙歧桿菌菌群數量沒有顯著增加，試驗組間雙歧桿菌數量也無明顯差異；發酵24 h后，所有試驗組雙歧桿菌數量都顯著高于對照組。其中，低聚果糖組由4.86 lg CFU/mL上升到8.24 lg CFU/mL，菊粉組上升到8.51 lg CFU/mL，甘露寡糖組上升到8.47 lg CFU/mL。對于乳酸桿菌，發酵6 h后，試驗組與對照組相比菌群數量都顯著增加，各試驗組間菌群數量無顯著性差異；發酵24 h后低聚果糖和菊粉組乳酸桿菌數量顯著高于對照組，而甘露寡糖組與對照組相比菌群數量無顯著差異。其中，低聚果糖組由4.21 lg CFU/mL上升到8.05 lg CFU/mL，菊粉組上升到8.23 lg CFU/mL。大腸桿菌組在發酵6 h后，對照組與試驗組相比菌群數量無顯著性差異；發酵24 h后，有且僅有低聚果糖組的大腸桿菌在顯著低于對照組，為7.71 lg CFU/mL。

2.5 3種益生元體外發酵對哈士奇幼犬腸道菌群產生短鏈脂肪酸濃度的影響

在體外發酵的第0，第6和第24小時取發酵液用高效液相色譜法測定發酵液中乳酸、乙酸和丙酸濃度。3種益生元對哈士奇體外發酵過程中產酸的變化分別如表7所示。

表7 不同樣品體外發酵過程中短鏈脂肪酸濃度的變化 單位：mmol/L

發酵6 h后，相較于對照組，僅有低聚果糖組的乳酸顯著降低，為18.65 mmol/L。發酵24 h后，試驗組與對照組相比，乳酸濃度顯著增加，其中低聚果糖組的乳酸濃度增加最多。乙酸組發酵6 h后，試驗組與對照組無顯著性差異；發酵24 h后試驗組與對照組相比乙酸濃度均顯著增加，其中甘露寡糖組增加最多，由11.69 mmol/L上升到15.88 mmol/L。對于丙酸組，發酵的24 h內試驗組與對照組間均無明顯規律。哈士奇幼犬糞便發酵液中低聚果糖組在發酵24 h內中乳酸濃度先減少后增加的原因可能是，乳酸在產生過程中可被其他共生的細菌轉化為乙酸或丙酸等短鏈脂肪酸[14]，但這些共生的細菌對低pH比較敏感，隨著pH的下降，這些細菌的活性被抑制，導致乳酸的含量又逐漸增加[15]。

3種益生元對哈士奇幼犬體外發酵過程中總短鏈脂肪酸的濃度變化結果如表8所示。總短鏈脂肪酸=乳酸+乙酸+丙酸。發酵24 h后，與其他組相比，低聚果糖組產生的總短鏈脂肪酸最多，由31.81 mmol/L增加到59.92 mmol/L。

表8 不同樣品體外發酵過程中總短鏈脂肪酸濃度變化 單位：mmol/L

2.6 3種益生元體外發酵對發酵液pH的影響

在一定程度上，發酵液pH的高低反映腸道菌群的致酸效果，3種益生元體外發酵過程中哈士奇幼犬糞便發酵液pH隨時間變化的結果如圖2所示。

圖2 發酵過程中pH的變化情況

隨著發酵時間的增加，各組發酵液的pH均在下降。在0～6 h內發酵液的pH下降速度較快，且對照組下降速度小于所有試驗組，低聚果糖組下降速度最快，由pH 7.42降至pH 6.33。在6～12 h內發酵液pH值下降的速度減緩，其中對照組的pH幾乎沒有變化，而低聚果糖組和菊粉組的pH仍保持一個較快的速度下降；24 h后低聚果糖組的pH降至最低，pH從7.42降至4.31，菊粉組次之，從pH 7.46降至pH 4.88。與腸道菌群的產酸結果進行比較，發現發酵液pH與短鏈脂肪酸并沒有明顯相關性。原因是pH除了與短鏈脂肪酸濃度有關外，還與酸產生、吸收和利用的相對速率及在發酵過程中產生的其他物質有關[16]。

3 結語

在改進犬糧配方的基礎上，考察添加不同量益生元時，犬糧經擠壓制粒后益生元保留率的變化，并通過體外發酵試驗比較3種益生元對哈士奇幼犬腸道的益生作用，結果表明：隨添加量的變化，3種益生元的保留率基本不變，其中低聚果糖保留率達到最高，約為90%；3種益生元均能不同程度促進哈士奇幼犬的腸道健康，其中只有低聚果糖可以顯著地抑制大腸桿菌的增長，參考其保留率和價格，選擇添加低聚果糖添加到幼犬犬糧更具有工業指導意義。