表面增強拉曼光譜法快速檢測咸鴨蛋中蘇丹紅

胡家勇，彭青枝，周陶鴻，林津，劉國嬌

1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院（武漢 430075）；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（動物源性食品中重點化學(xué)危害物檢測技術(shù)）（武漢 430075）；3.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心（武漢 430075）

蘇丹紅為親脂性的偶氮染料，對人體器官如肝腎等具有明顯毒性，經(jīng)常性食用含蘇丹紅的食品會導(dǎo)致器官發(fā)生癌變[1]。由于蘇丹紅增色效果明顯并且價格比較低廉，蘇丹紅增色后的食品不僅顏色看上去鮮艷同時還不容易褪色，因此，某些不法的商販為牟取利潤將蘇丹紅偶氮染料添加到鴨子的飼料中，鴨子食用含蘇丹紅的飼料后，在體內(nèi)代謝然后產(chǎn)出蛋黃呈現(xiàn)紅色的鴨蛋，以此冒充紅心鴨蛋。對于食品中蘇丹紅的檢測方法包括HPLC法、HPLC-MS法、UPLC-MS/MS法等[2-7]。雖然色譜法是蘇丹紅檢測的常用方法，但是色譜法存在一些缺陷，如檢測周期長、無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗等。開發(fā)一種快速高效且能實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測食品中蘇丹紅的方法具有重要意義。

近年來，隨著科研工作者對表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)研究的不斷深入，SERS技術(shù)在食品質(zhì)量安全快速檢測方面的得到較為廣泛的應(yīng)用[8-13]，SERS技術(shù)因其可以實現(xiàn)實時、原位檢測，而且具有靈敏度高、檢測周期短等優(yōu)點[14-15]，使得其已發(fā)展成食品中危害物快速檢測的有力工具，但是由于微痕量檢測中拉曼信號微弱會受到復(fù)雜體系中其它未知組分的干擾，使得表面增強拉曼光譜在微痕量危害物的檢測中依然存在很大的挑戰(zhàn)。分子印跡固相萃取是一種高效、高選擇性的樣品預(yù)處理技術(shù)，能夠有效去除對目標(biāo)物分析的干擾物質(zhì)，并且能夠富集痕量組分，提高分析靈敏度，使其成為表面增強拉曼光譜在微痕量危害物檢測中較為理想的前處理技術(shù)。基于分子印跡固相萃取結(jié)合表面增強拉曼光譜在食品中微痕量危害物的檢測也有相關(guān)報道，如Xiao等[16]利用印跡固相萃取結(jié)合表面增強拉曼光譜法快速分析豬組織中的萊克多巴胺。

試驗建立一種基于MIPS-SERS技術(shù)快速定性檢測咸鴨蛋中蘇丹紅的方法，以期為咸鴨蛋中蘇丹紅快速篩查提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；金納米溶膠、蘇丹紅凈化管[普拉瑞思科學(xué)儀器（蘇州）有限公司]；Copure蘇丹紅分子印跡專用柱（深圳逗點生物技術(shù)有限公司）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司）；inVia拉曼光譜儀（英國Renishaw公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取1 g咸鴨蛋黃于15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋1 min，超聲5 min，按3 900 r/min離心5 min，收集上層清液，殘渣重復(fù)提取4次，合并所有上清液，于40 ℃氮吹濃縮至約5 mL，此為提取液。

1.3.2 樣品的凈化

將提取液全部轉(zhuǎn)移至蘇丹紅凈化管中，振蕩30 s，按3 900 r/min離心1 min，將上層清液加入蘇丹紅分子印跡柱（使用前用5 mL正己烷活化），加入5 mL正己烷淋洗，棄去流出液，加5 mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，渦旋1 min，此為待測液。

1.3.3 檢測

吸取500 μL納米金溶膠于檢測瓶中，加入100 μL待測液，振搖混勻后加入100 μL 1%的氯化鈉溶液，振搖混勻后上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.3.4 拉曼光譜儀參數(shù)設(shè)定

拉曼光譜儀參數(shù)設(shè)定見表1。

表1 拉曼光譜儀參數(shù)

1.3.5 進(jìn)樣方式

試驗所采用的檢測儀器為顯微共聚焦拉曼光譜儀，顯微鏡聚焦程度對儀器的檢測結(jié)果影響很大，為避免每次檢測時的反復(fù)聚焦，同時也為確保試驗條件的統(tǒng)一，試驗設(shè)計如圖1所示的進(jìn)樣裝置，此裝置可確保顯微鏡聚焦程度的一致性和試驗結(jié)果的重復(fù)性。試驗采用拉桿式注射器抽吸的方式進(jìn)樣，待樣品灌滿測試管后開始檢測。為避免殘留干擾檢測，在進(jìn)行下一個樣品的檢測前需用拉桿注射器抽吸去離子水使其充滿管路后推射至廢液瓶中，如此重復(fù)3～5次。

圖1 進(jìn)樣示意圖

1.4 結(jié)果分析

使用拉曼光譜自帶軟件WiRE 5.0進(jìn)行拉曼光譜采集以及拉曼光譜的預(yù)處理。用Excel軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹紅分子振動模式歸屬[16-19]

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度20 mg/L）表面增強拉曼光譜圖如圖2所示。可以看出蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼特征峰。蘇丹紅Ⅰ的特征峰有685，722，749，843，978，1 024，1 162，1 223，1 251，1 340，1 377，1 478，1 531，1 577和1 597 cm-1，其中：722 cm-1為苯環(huán)的C—H環(huán)外振動；749 cm-1對應(yīng)于苯環(huán)的扭轉(zhuǎn)振動、—OH基平面內(nèi)的彎曲振動、C—O的伸縮振動；978 cm-1為苯氮的＝N-phenyl伸縮振動；843 cm-1為C—N鍵的伸縮振動；1 162，1 223和1 340 cm-1為環(huán)內(nèi)變形，還伴隨N—C拉伸振動、C—H面內(nèi)擺動；1 377 cm-1為CH3-phenyl伸縮振動；1 597 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動。

蘇丹紅Ⅱ的特征峰有711，847，924，979，1 022，1 226，1 242，1 307，1 340，1 374，1 491和1 595 cm-1，其中：979 cm-1為苯氮的＝N-phenyl伸縮振動；1 022 cm-1是C—H面內(nèi)擺動；1 242和1 491 cm-1為C＝C收縮振動，還伴隨著C—H面內(nèi)擺動、O—H面內(nèi)擺動；1 374 cm-1為CH3-phenyl伸縮振動；1 226和1 340 cm-1為環(huán)內(nèi)變形，還伴隨N—C拉伸振動；1 595 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動。

蘇丹紅Ⅲ的特征峰有712，987，1 134，1 184，1 230，1 338，1 394，1 415，1 439，1 496和1 594 cm-1，其中：987 cm-1是萘環(huán)的呼吸振動；1 134，1 187和1 230 cm-1為C—H面內(nèi)擺動，其中SERS最強峰1 134 cm-1為萘環(huán)的C—H和O—H的面內(nèi)擺動；1 394，1 415，1 439，1 496和1 594 cm-1是N＝N面內(nèi)的伸縮振動，還伴隨苯環(huán)和部分C＝C伸縮振動[18]；1 594 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動。

蘇丹紅Ⅳ的特征峰有688，713，805，890，986，1 098，1 175，1 199，1 259，1 342，1 381，1 452，1 489和1 594 cm-1，其中：986 cm-1是萘環(huán)的呼吸振動；1 096，1 199和1 259 cm-1是C—H的面內(nèi)搖擺；1 381 cm-1為CH3-phenyl伸縮振動；1 489 cm-1為C＝C收縮振動，還伴隨著C—H面內(nèi)擺動、O—H面內(nèi)擺動；1 594 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動。

2.2 定性檢測方法建立

2.2.1 定性檢測

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ及試劑空白表面增強拉曼光譜圖如圖3所示。拉曼光譜譜圖又被稱為指紋圖譜，具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)其對應(yīng)的拉曼光譜圖都不一樣，根據(jù)拉曼光譜信號強度分為骨架特征峰和指紋特征峰，因骨架特征峰信號比較明顯，因此選擇蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ強度較大的拉曼骨架峰作為它們的定性特征峰，蘇丹紅Ⅰ選擇722，977，1 223，1 377，1 478和1 577 cm-1（一階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1）作為其表面增強拉曼定性檢測的特征峰，蘇丹紅Ⅱ選擇711，979，1 226，1 374，1 491和1 595 cm-1（1階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1）作為其表面增強拉曼定性檢測的特征峰，蘇丹紅Ⅲ選擇1 134，1 184，1 230，1 394，1 496和1 594 cm-1（一階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1）作為其表面增強拉曼定性檢測的特征峰，蘇丹紅Ⅳ選擇986，1 098，1 175，1 259，1 381，1 452和1 594 cm-1（1階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1）作為其表面增強拉曼定性檢測的特征峰。

圖3 蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液表面增強拉曼光譜圖

將待測的樣品按1.3.1～1.3.2的方式進(jìn)行前處理然后按1.3.3的方式進(jìn)行檢測，根據(jù)SERS譜圖的拉曼峰位移，對咸鴨蛋中是否含有蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進(jìn)行定性判定：如果樣品中同時存在蘇丹紅Ⅰ的定性特征峰，那么可以判定該樣品含有蘇丹紅Ⅰ；否則，不能判定樣品中是否含有蘇丹紅Ⅰ，需要進(jìn)一步試驗驗證。蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ同理定性評估。

2.3 MIPS-SERS檢測體系的方法學(xué)評價

2.3.1 加標(biāo)回收率

陽性模擬樣品的制備及前處理：配制質(zhì)量濃度為1，2和10倍檢出限的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品溶液（正己烷為溶劑），取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到經(jīng)食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法檢測不含有蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的蛋黃中，充分混合后，靜置過夜。將1 g陽性模擬樣品和陰性實際樣品按1.3.1～1.3.2進(jìn)行提取凈化，得到待測液。待測液經(jīng)濾膜過濾后用高效液相色譜法測試（測試條件按照GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[20]），結(jié)果如表2所示。蘇丹紅Ⅰ回收率82.4%～98.5%、精密度1.3%～3.7%，蘇丹紅Ⅱ回收率82.3%～97.3%、精密度3.4%～5.5%，蘇丹紅Ⅲ回收率83.8%～97.3%、精密度4.5%～6.5%，蘇丹紅Ⅳ回收率82.9%～95.6%、精密度3.0%～6.1%。加標(biāo)樣品的測試結(jié)果表明分子印跡固相萃取法可用于咸鴨蛋中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的前處理。

表2 陽性模擬樣品中蘇丹紅加標(biāo)的回收率

2.3.2 最低檢出濃度

對含不同濃度蘇丹紅的咸鴨蛋蛋黃陽性模擬樣品進(jìn)行提取凈化后用拉曼光譜儀檢測，得到表面增強拉曼光譜圖，如圖4所示。隨著蘇丹紅濃度的降低，其特征拉曼骨架峰強度信號也隨著降低，蘇丹紅Ⅰ濃度低至0.5 mg/kg時，其特征峰拉曼信號極其微弱，但蘇丹紅Ⅰ濃度為1 mg/kg時，其特征峰拉曼信號還較為明顯，因此試驗方法確定蘇丹紅Ⅰ的最低檢出濃度為1 mg/kg。同理，蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的最低檢出濃度分別為1，0.5和0.5 mg/kg。

圖4 不同含量蘇丹紅染料模擬陽性樣品的拉曼圖譜

2.3.3 方法特異性考察

選取經(jīng)國標(biāo)方法篩選出來的陰性樣本，加入1/2，1和2倍檢出限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1～1.3.2對加標(biāo)樣品進(jìn)行提取凈化，根據(jù)1.3.3～1.3.4對待測液進(jìn)行上機(jī)檢測，檢測結(jié)果見表3。對于陰性樣品，檢測結(jié)果全為陰性，特異性均為100%，假陽性率均為0；對于陽性樣品，檢測結(jié)果全為陽性（+），靈敏度為100%，假陰性率為0，相對準(zhǔn)確度為100%。

表3 特異性考察結(jié)果

2.4 實際樣品SERS檢測與HPLC方法的比對

試驗選取經(jīng)國標(biāo)方法篩選出來的陰性樣本25個批次，隨機(jī)選取其中20個樣品進(jìn)行模擬陽性樣本的制作，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ模擬陽性樣品各5個，含量為10 mg/kg，隨機(jī)編號為1～25，按照1.3.1～1.3.2對25批次樣品進(jìn)行提取凈化，根據(jù)1.3.3～1.3.4對待測液進(jìn)行上機(jī)檢測，檢測結(jié)果見表4。SERS法定性檢測的陰陽性與HPLC法定量檢測結(jié)果相一致。

表4 實際陰性樣品及模擬陽性樣品中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的測定

2.5 SERS檢測干擾因素分析

由于微痕量檢測中會出現(xiàn)拉曼光譜信噪比低、微弱信號被熒光背景淹沒、復(fù)雜體系中其他未知組分的干擾等因素的影響，SERS信號自動識別存在很大挑戰(zhàn)。為最大程度提高SERS的靈敏度、提高SERS檢測的檢出能力，試驗采用分子印跡固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化，因分子印跡固相萃取具有很強的特異性，該前處理方法可很好地消除未知組分的干擾。此外，該定性方法選擇蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的多個骨架特征峰作為其定性特征峰，確保定性準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

基于表面增強拉曼光譜技術(shù)，建立咸鴨蛋中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ快速定性檢測的方法。該方法具有高靈敏度、強特異性、檢測周期短、可滿足現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，適用于大批量的樣品的靶向篩查。該方法蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的最低檢測限分別為1，1，0.5和0.5 mg/kg。建立SERS法定性檢測咸鴨蛋中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ，以期為咸鴨蛋中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的現(xiàn)場快速定性檢測提供技術(shù)支撐。