LC-AJS ESI-MS/MS同時測定果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸

孫莉，周玉，余義，劉智康，毛從興，唐艷榮

1.黃鶴樓酒業有限公司（武漢 430050）；2.湖北信嘉檢測科技有限公司（咸寧 437000）；3.黃鶴樓酒業（咸寧）有限公司（咸寧 437000）

果露酒是以醇化果加酒精、果汁、水調制而成的露酒。果露酒屬于露酒。相關標準對露酒的定義，露酒是以蒸餾酒、清香型汾酒或食用酒精為酒基，以藥食兩用的動植物精華，按先進工藝加工而成，改變其原酒基風格的飲料酒。果露酒是以葡萄、獼猴桃或其他漿果等為原料，經分選、破碎、去梗、發酵、儲酒、調配釀制成別有風味的葡萄酒、獼猴桃酒等美味酒。

隨著科技的不斷發展，許多企業為追求利潤的最大化，以及用最短的時間生產出更多的果露酒，往往會選擇通過往酒基中添加各種食品添加劑，以此達到高產的效果。而過多的添加劑被人體吸收后，人體器官如果不能及時代謝掉，如人工合成的阿斯巴甜、紐甜等，并且過多的使用食品添加劑導致身體器官代謝負擔過重，長此以往將會導致身體各項機能的下降，嚴重危害人體健康。

針對食品添加劑的檢測方法有許多，如液相色譜法、液相色譜質譜聯用法、離子交換法等，試驗通過液相色譜質譜聯用儀對果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸進行定性和定量分析。針對目標物濃度殘留的問題進行分析，盡可能完善檢測方法，使方法對果露酒檢測的使用性達到最佳。利用檢測手段以期能更加及時有效地對果露酒產品中添加劑含量進行控制，保護消費者的身體健康作出努力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，J.TBaker）；一級水（德國默克密理博有限公司）；乙酸銨、冰乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；異丙醇（色譜純，J.TBaker有限公司）；水相濾膜（0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司）；安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、苯甲酸、山梨酸、檸檬酸標準品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：準確稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量一級水進行超聲溶解，待溶解后用水定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：準確稱取220 g乙酸鋅，加入適量一級水進行超聲溶解后，加入30 mL冰乙酸，充分混勻后用水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

液相色譜-三重串聯四極桿質譜儀、Agilent SBC18RRHD（2.1×50 mm，1.8 μm）色譜柱（美國Agilent公司）；電子天平（萬分之一，梅特勒托利多科技中國有限公司）；超聲波清洗池（KQ-250E型，昆山市超聲儀器有限公司）；抽濾裝置（1 000 mL，天津津騰實驗設備有限公司）；0.22 μm水相濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

1.3 方法原理

對市購果酒和露酒進行感官分析，對于澄清透明的樣品，采用加水稀釋，超聲混勻方式進行前處理；對于渾濁度較高的樣品，采用加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液進行沉淀，取上清液過0.22 μm濾膜上機檢測。前處理后的樣品進入液相色譜進行分離，經質譜檢測器進行定性、定量分析，試驗方法均采用外標法對樣品進行含量測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相的配制

流動相A（0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）：取1 mL乙酸（分析純）和0.39 g乙酸銨（分析純）加入1 000 mL一級水，經過0.22 μm水相濾膜抽濾，超聲混勻除去CO2，超聲時間不宜過長，避免流動相基質變化，影響色譜峰分離效果。

流動相B（甲醇）：色譜純，為避免抽濾過程中溶入其他雜質，只需超聲除去CO2即可。

1.4.2 標準儲備溶液

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜標準儲備液（100 mg/L）：準確稱取0.01 g標準品于6個100 mL容量瓶中，用一級水溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

苯甲酸、山梨酸標準儲備液（500 mg/L）：準確稱取0.05 g標準品于2個100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

檸檬酸標準儲備液（1 000 mg/L）：準確稱取0.1 g標準品于100 mL容量瓶中，用一級水溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

1.4.3 標準曲線溶液配制

混合標準溶液：分別吸取一定體積的上述標準儲備液于10 mL容量瓶中用一級水定容，混勻后得安賽蜜10.00 mg/L、糖精鈉10.00 mg/L、甜蜜素10.00 mg/L、三氯蔗糖20.00 mg/L、阿斯巴甜10.0 mg/L、紐甜10.0 mg/L、苯甲酸25.0 mg/L、山梨酸25 mg/L和檸檬酸50 mg/L混合標準溶液，于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

混合標準工作液：分別移取適量體積的混合標準溶液，用一級水配制成混合標準工作液，現配現用。

1.4.4 儀器條件

1.4.4.1 色譜條件

Agilent SB-C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相A為0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸銨，流動相B為甲醇（梯度洗脫，見表1），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.4.4.2 質譜條件

帶有鞘氣的電噴霧離子源，正/負離子模式，帶鉑鎳涂層的導電毛細管，多反應監測（MRM）模式，電子倍增電壓正模式200 V，負模式200 V，離子源溫度325 ℃，霧化氣流速8 L/min，氣簾氣壓30 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，噴嘴電壓正模式300 V，負模式500 V，電噴霧電壓正模式3 500 V，負模式3 000 V，按此條件對10種食品添加劑的離子對進行摸索分析，確定目標化合物的離子對條件，見表2。

表2 10種食品添加劑的MRM參數

1.4.5 樣品的制備

稱取2 g酒樣于50 mL離心管中，對于澄清透明的樣品，加水稀釋至25 mL，超聲混勻后，取上清液過0.22 μm濾膜上機檢測；對于渾濁度較高的樣品，稱取2 g酒樣于50 mL離心管中，加水稀釋至25 mL，加入2 mL亞鐵氰化鉀（92 g/L）和2 mL乙酸鋅（183 g/L）溶液進行沉淀，置于5 000 r/min離心機中離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜上機檢測。

1.4.6 空白試驗

按照樣品制備步驟不加樣品，進行處理后上機檢測。

1.5 結果計算

樣品中10種食品添加劑的含量按（1）計算。

式中：X為樣品中10種食品添加劑含量，g/kg；c為測定溶液中10種食品添加劑含量，μg/L；c0為測定空白溶液中10種食品添加劑含量，μg/L；V為樣液的最終定容體積，mL；m為取樣量，g；f為樣品的稀釋倍數；1 000×1 000為μg/L轉換為g/kg的換算因子。

2 結果與分析

2.1 色譜條件和質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化

通過對10種食品添加劑物理和化學信息的分析，分別以0.1%乙酸-甲醇、5 mmol/L乙酸銨-甲醇、0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。由于不同流動相的pH不同，對色譜柱中的填料物質會起到一定作用，有的流動相有利于目標物質的分離，有的流動相則會抑制目標物出峰，導致峰形異常，如峰拖尾、峰前伸、雙頭峰及鬼峰等現象，甚至于不出峰，均不利于對樣品進行定性及定量分析。通過利用上述流動相對10種添加劑進行色譜峰分離，準備好單標物質，將準備好的單標物質進入色譜柱查看出峰效果，需保證保留時間、峰形、響應均良好且分離效果好，靈敏度和響應合適。結果表明，用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相時，物質分離度、峰形、響應值及保留時間的穩定性均優于其他流動相，故選用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動相進行洗脫。見圖1。

圖1 10種食品添加劑混合標準溶液的總離子流色譜圖

10種添加劑的出峰時間依次為：0.996 min，安賽蜜；1.500 min，阿力甜；2.045 min，糖精鈉蜜；3.000 min，甜蜜素；4.522 min，三氯蔗糖；4.846 min，阿斯巴甜；5.000 min，苯甲酸；5.100 min，山梨酸；6.460 min，紐甜；11.500 min，檸檬酸。

2.1.2 質譜條件的優化

將單標純品目標物標準溶液不經過色譜柱注入質譜，分別進行正、負離子模式，在Scan狀態下進行全掃描檢測，得到TIC總離子流圖，根據總離子流圖標記出特征離子峰，進行SIM模式掃描，將標記出的準分子離子峰進行單獨掃描，得到EIC提取離子流圖。用碰撞氣惰性氣體高純氮氣攻擊該前體離子，獲得其二級質譜圖及相應的子離子。由于試驗方法是同時分析10種目標物質，且各物質間質荷比差異較大，所以在進行電離模式選擇時發現有的目標物在正離子模式下靈敏度及響應比負離子模式更高，而有的目標物則恰恰相反，所以試驗方法中既有正離子模式也有負離子模式的存在，但2種模式同時存在則對電離毛細管的要求較高，需使用帶有鉑鎳涂層的導電毛細管，才能在短時間內完成正負模式的快速切換。利用多反應監測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對裂解電壓、毛細管電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質譜參數進行優化，使各監測離子豐度和信號達到最佳。

通過設置Precursor Ion模式對母離子進行確認，通過設置Product Ion模式下，利用碰撞池電壓對母離子進行轟擊，得到相應的子離子碎片，選擇其中離子豐度高的離子作為子離子，且每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括1個母離子和2個子離子，試驗方法通過設置均能確定10種添加劑的母離子和2個子離子。

經過質譜條件設置，確定試驗方法采用正、負離子模式采集，該模式下的質譜分析參數見表2。

2.2 標準曲線、線性范圍和方法檢出限、定量限

將配制好的混合標準工作液按優化好的儀器條件上機進行測定，以目標組分色譜峰面積對相應的標準溶液質量濃度進行線性回歸分析，得到各自的線性回歸方程和相關系數。參考GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中檢出限和定量限的評定方法，采用信噪比法評估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比≥3∶1，定量限可接受的信噪比≥10∶1。為保證方法的實用性，選擇將10種添加劑分別加入果露酒酒基中（蒸餾酒、清香型白酒或食用酒精），模擬10種添加劑在酒基中的狀態，選擇食用酒精為基質，在食用酒精樣品中添加10種添加劑的標準儲備液，進行方法檢出限和定量限的探底試驗。在保證信噪比滿足相關標準使用要求的前提下，也要保證峰形的完整，且峰形無異常，通過對方法的優化確保基質對方法檢測結果影響最小。分別對各目標化合物線性范圍的最低濃度點進行信噪比分析，結果見表3。

表3 10種食品添加劑的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度

市面上果酒和露酒品種繁多，比較有代表性的是雞尾酒、葡萄酒、各種花釀的酒，故選取雞尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒3種果露酒進行加標回收試驗。在稱取好的樣品中準確加入一定量的10種食品添加劑混合標準溶液，配制成低、中、高3個不同添加水平，按上述試驗方法前處理，平行測定6次，扣除樣品本底含量后計算結果見表4。

表4 果露酒中10種食品添加劑的加標回收率和精密度（n=6）

經檢測，所選取的樣品中雞尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒中山梨酸、苯甲酸和檸檬酸各自有檢出，本底值在1.10×10-3～3.20×10-3g/kg之間，其他7種甜味劑均未檢出。扣除樣品本底值后計算結果表明，各目標化合物平均加標回收率在88.4%～110%之間，相對標準偏差為1.2%～7.6%，方法的準確度和精密度均符合食品中添加劑殘留量分析的要求。

3 結論

建立液相色譜-質譜串聯技術檢測方法，使用AJS ESI離子源同時測定果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸含量的方法，并對該方法進行了優化處理。從多方面保證方法對于果露酒檢測的準確性和適用性，最大限度降低基質效應對于檢測結果的影響。為驗證方法的實用性，參考相關方法驗證學標準，從多角度、多維度對試驗方法進行方法學驗證，保證方法的完整性和全面性。試驗方法前處理簡單易操作，有效去除蛋白和色素問題，檢測靈敏度高，適合對果露酒中10種添加劑進行大批量定性篩查和定量分析，為食品安全監測提供技術支持。